煙曲霉的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展

陳顯振 方文捷朱信霖廖萬(wàn)清潘煒華

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003; 2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

【關(guān)鍵字】 煙曲霉；翻譯后修飾；磷酸化；乙?；?；糖基化；甲基化

前 言

煙曲霉是一種常見的機(jī)會(huì)性致病真菌，其孢子漂浮在空氣中，人體每天吸入上百個(gè)孢子，免疫功能正常人群可通過(guò)自身免疫清除吸入的孢子，而在免疫抑制患者中常引起曲霉病[1-2]，曲霉病分為非侵襲性和侵襲性兩大類，其中侵襲性肺曲霉病為嚴(yán)重的感染類型，死亡率可高達(dá)50%～100%[3]。唑類藥物為侵襲性肺曲霉病的臨床一線用藥，但近年來(lái)全球陸續(xù)報(bào)道煙曲霉對(duì)唑類抗真菌藥物的耐藥率逐年遞增。荷蘭一項(xiàng)基于1994—2016年的煙曲霉唑類耐藥趨勢(shì)研究共收集4 268株菌株，結(jié)果顯示唑類耐藥率高達(dá)4.2%(179/4268)，且近5年明顯呈遞增趨勢(shì)[4]。鄧淑文等[5]一項(xiàng)基于159株煙曲霉的研究表明，煙曲霉唑類耐藥現(xiàn)象在我國(guó)也日趨明顯。發(fā)病率的升高，治療藥物的局限性，促使我們對(duì)煙曲霉的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更多的研究。目前關(guān)于煙曲霉的研究主要集中在基因與蛋白質(zhì)水平，但是很多生理過(guò)程從蛋白質(zhì)或基因豐度水平不足以解釋，因?yàn)樵S多蛋白的活性是在翻譯后水平上調(diào)節(jié)的。翻譯后修飾即通過(guò)在一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸殘基上添加修飾基團(tuán)，從而改變?cè)摰鞍椎纳砉δ?。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉翻譯后修飾不僅可以影響蛋白結(jié)構(gòu)，還可以調(diào)控蛋白的活性、穩(wěn)定性、定位及蛋白質(zhì)間互作關(guān)系[6]，進(jìn)而調(diào)控著煙曲霉的菌絲及孢子生長(zhǎng)、毒力、應(yīng)激反應(yīng)及其對(duì)抗真菌藥物敏感性等生理過(guò)程[7-8]。本文回顧了近些年關(guān)于煙曲霉翻譯后修飾的相關(guān)文章，從該角度闡述煙曲霉的致病機(jī)制并期待挖掘新的藥物靶點(diǎn)，研究主要集中在磷酸化、乙酰化及糖基化等(見表1)。

表1 翻譯后修飾調(diào)控的生理過(guò)程

1 磷酸化修飾

磷酸化修飾調(diào)控著煙曲霉眾多的生命活動(dòng)，該過(guò)程由蛋白激酶與蛋白磷酸酶相互協(xié)調(diào)來(lái)完成，主要通過(guò)在肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側(cè)鏈羥基添加磷酸基團(tuán)，來(lái)改變蛋白的活性[11]，進(jìn)而調(diào)控著煙曲霉細(xì)胞形態(tài)、藥物敏感性、毒力及應(yīng)激等過(guò)程。

很多信號(hào)通路的蛋白分子通過(guò)磷酸化進(jìn)行信號(hào)的傳遞。蛋白激酶A(PKA)可以激活下游分子磷酸化，其介導(dǎo)的信號(hào)通路在煙曲霉菌絲生長(zhǎng)及毒性中發(fā)揮著重要作用。PKA由催化亞基PkaC和調(diào)節(jié)亞基PkaR組成，任何亞基突變，均會(huì)抑制煙曲霉生長(zhǎng)與孢子的形成，并且導(dǎo)致毒力降低[32-34]。除了cAMP可以激活PKA外，催化亞基(PkaC)殘基的磷酸化也會(huì)導(dǎo)致PKA的激活。通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉PKA催化亞基上有4個(gè)特殊的磷酸化位點(diǎn)，且證實(shí)了這些位點(diǎn)的磷酸化在調(diào)控生長(zhǎng)、分生孢子、脅迫耐受性和毒性方面起關(guān)鍵作用[7]。絲裂原激活蛋白SakA、MpkC是煙曲霉的兩個(gè)壓力應(yīng)激蛋白激酶，當(dāng)SakA、MpkC的上游激酶突變時(shí)，SakA、MpkC均失去磷酸化，使煙曲霉對(duì)高滲壓力、ROS(活性氧)、卡泊芬凈等應(yīng)激壓力的敏感性均上升，毒力減弱[35-36]，提示磷酸化在應(yīng)

激過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Castro等[37]通過(guò)突變SchA激酶，抑制下游蛋白的磷酸化后，發(fā)現(xiàn)煙曲霉表現(xiàn)出對(duì)雷帕霉素、高鈣濃度及高滲脅迫的敏感性增加。與野生株感染小鼠相比，在SchA突變株感染小鼠模型中，孢子及菌絲均發(fā)育不良、毒力下降，由此可見磷酸化在煙曲霉形態(tài)及毒力中同樣發(fā)揮重要作用[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)通過(guò)磷酸化修飾也參與煙曲霉應(yīng)激反應(yīng)及毒力的調(diào)控[38]。磷酸化還可以通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路中的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)介導(dǎo)各種生理過(guò)程[8-9]。

除了信號(hào)通路過(guò)程中存在磷酸化外，煙曲霉的動(dòng)力蛋白同樣通過(guò)磷酸化修飾來(lái)調(diào)控生理過(guò)程。肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白均為煙曲霉動(dòng)力蛋白，對(duì)煙曲霉分泌過(guò)程、極性及細(xì)胞分裂發(fā)揮重要的作用。Class V Myosin(MyoE)是煙曲霉肌球蛋白的一種，MyoE的磷酸化與去磷酸化過(guò)程在煙曲霉的生長(zhǎng)與形態(tài)學(xué)發(fā)揮重要作用，調(diào)控著菌絲生長(zhǎng)及菌絲分隔[10]。Cofilin蛋白也是存在于煙曲霉的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，具有解聚合的作用，參與胞內(nèi)多種重要生命活動(dòng)，如細(xì)胞遷移、黏附、分裂及凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)Cofilin蛋白的磷酸化可以激活Cofilin蛋白解聚合活性[39]。

部分酶也存在磷酸化位點(diǎn)，例如，Kin1蛋白激酶是真核生物PAR-1/MARK/MELK家族中的一員，在煙曲霉菌絲分隔及毒力中發(fā)揮著不可或缺的作用。Juvvadi等[40]通過(guò)液相質(zhì)譜技術(shù)鑒定出Kin1是一種磷酸化蛋白，鈣調(diào)磷酸酶可以使Kin1蛋白去磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Kin1蛋白在不同應(yīng)激中發(fā)揮作用。AfPrdx6是煙曲霉過(guò)氧化物酶，通過(guò)Western Blotting鑒定出該酶存在磷酸化修飾位點(diǎn)，在Erk2激酶的作用，煙曲霉的AfPrdx6的活性大幅增加[41]。煙曲霉中蛋白質(zhì)磷酸化修飾還可以參與蛋白質(zhì)降解過(guò)程。Fbx15是煙曲霉蛋白質(zhì)降解過(guò)程中重要的蛋白，它連接目標(biāo)蛋白與泛素基團(tuán)，從而標(biāo)記蛋白促進(jìn)降解。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)應(yīng)激條件下，F(xiàn)bx15呈磷酸化狀態(tài)位于細(xì)胞質(zhì)中，而在氧化應(yīng)激條件下，F(xiàn)bx15迅速發(fā)生去磷酸化，與其連接的E3酶亞基SkpA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[42]。

2 乙?；揎?/h2>

乙?；揎検侵冈诿?非酶的作用下將乙酰CoA(乙酰輔酶A)的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)氨基酸殘基上。乙?；揎椫饕譃閮深悾喊l(fā)生在蛋白N端的乙酰化修飾，以及發(fā)生在蛋白賴氨酸上的乙酰化修飾，其中賴氨酸的乙?；揎検俏覀兡壳把芯康闹攸c(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉中賴氨酸乙酰化修飾廣泛存在，由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)與組蛋白去乙?；?HDACs)共同調(diào)控，是一種可逆性翻譯后修飾，其參與調(diào)控?zé)熐股L(zhǎng)、應(yīng)激反應(yīng)及毒力等重要生理功能[17]。借助于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)修飾組學(xué)分析手段，發(fā)現(xiàn)HATs和HDACs不僅調(diào)控著組蛋白的乙酰化及去乙?；^(guò)程，也調(diào)控著其他非組蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白(Hsp90)等。

組蛋白乙?；揎椨绊懞诵◇wDNA片段長(zhǎng)度，通過(guò)組蛋白去乙?；种苿?TSA)處理煙曲霉，發(fā)現(xiàn)TSA-處理組的核小體DNA長(zhǎng)度大于未處理的片段[12]。AfRtt109是煙曲霉中組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，該酶使組蛋白H3亞基K9位、K27與K56發(fā)生乙?；?，當(dāng)敲除Afrtt109時(shí)，發(fā)現(xiàn)煙曲霉的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢減少，在大蠟螟中其感染毒力下降，對(duì)于DNA損傷因素敏感性增強(qiáng)[43]。另有研究發(fā)現(xiàn)GcnE也為煙曲霉中的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)gcnE突變時(shí)，孢子形成相關(guān)基因flbB與brlA表達(dá)下調(diào)，產(chǎn)孢量降低[44]。HdaA為煙曲霉組蛋白去乙酰化酶，當(dāng)敲除hdaA基因后，煙曲霉的生長(zhǎng)出現(xiàn)缺陷，但是其毒力并沒有降低，研究還發(fā)現(xiàn)該酶在孢子及次生代謝物產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用[45]。

半乳糖氨基半乳糖(GAG)，由半乳糖和N-乙酰半乳糖胺殘基經(jīng)過(guò)α-1-4鍵線性連接而成的骨架蛋白，是煙曲霉生物膜合成中不可或缺的因子，也是重要的毒力因子[46]。Agd3是GAG的去乙?；?，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除agd3時(shí)，GAG將不能發(fā)生去乙?；?，菌株生物膜形成過(guò)程受損，煙曲霉毒力下降[15]，GAG的去乙?；跈C(jī)體免疫反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用[47]。此外，一些伴侶蛋白也存在乙?；稽c(diǎn)，Hsp90是一種重要的分子伴侶蛋白，可以活化多種蛋白，在煙曲霉形態(tài)改變、毒力及應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[16]。通過(guò)液相質(zhì)譜檢測(cè)出Hsp90蛋白存在2個(gè)乙?；揎椢稽c(diǎn)(K27A、K271A)，突變乙?；揎椢稽c(diǎn)時(shí)，煙曲霉的毒力下降，并且對(duì)伏立康唑及卡泊芬凈的藥物敏感性增強(qiáng)[16,48]。

3 糖基化修飾

蛋白質(zhì)糖基化是一種常見的翻譯后修飾，碳水化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白，糖基化修飾通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性、穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控?zé)熐股磉^(guò)程[26,49]。蛋白質(zhì)糖基化修飾在煙曲霉的細(xì)胞壁合成、生長(zhǎng)及毒力等方面發(fā)揮著重要作用[50]。

真菌細(xì)胞壁作為抵御外界環(huán)境重要屏障，含有大量多糖及發(fā)生糖基化修飾的蛋白，因此干擾細(xì)胞壁表面蛋白的翻譯后修飾將影響煙曲霉細(xì)胞壁的合成及毒力[6]。很多糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞壁蛋白糖基化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如Gel1、Gel2，Ecm33p均是煙曲霉中的β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，可轉(zhuǎn)移N-聚糖至底物蛋白，使底物蛋白發(fā)生糖基化，研究發(fā)現(xiàn)敲除gel1不會(huì)導(dǎo)致表型改變，而敲除gel2或ecm33p時(shí)，煙曲霉表現(xiàn)出生長(zhǎng)減慢、異常孢子形成、毒力減弱和細(xì)胞壁成分改變，進(jìn)一步構(gòu)建Gel1、Gel2、Ecm33p去N-糖基化菌株，結(jié)果顯示N-糖基化缺失株比N-糖基化正常菌株的細(xì)胞壁成分減少，進(jìn)而影響Gel1、Gel2的膜定位及降解[18-21]。Afstt3為煙曲霉細(xì)胞壁蛋白相關(guān)的低聚糖轉(zhuǎn)移酶，它可以將N-聚糖轉(zhuǎn)移到新生多肽。通過(guò)抑制Afstt3，減少低聚糖糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁糖蛋白減少，進(jìn)而導(dǎo)致了煙曲霉生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞壁完整性(CWI)受損[22]。

另一種發(fā)生于細(xì)胞壁蛋白的糖基化修飾為甘露糖基化修飾，由甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMTs)介導(dǎo)，當(dāng)敲除不同的PMT基因時(shí)，煙曲霉的菌絲形態(tài)、對(duì)棘白菌素類藥物的敏感性及細(xì)胞壁成分均會(huì)出現(xiàn)不同的改變[23-24]。新發(fā)現(xiàn)的半乳糖呋喃糖基轉(zhuǎn)移酶GfsA的功能是轉(zhuǎn)移半乳呋喃糖至半乳甘露聚糖蛋白或其他糖蛋白。敲除gfsA基因后，煙曲霉形態(tài)異常，菌絲及孢子的形成受抑制，對(duì)米卡芬凈及伏立康唑的藥物敏感性增強(qiáng)[51-52]，提示半乳糖呋喃糖基化，在煙曲霉形態(tài)、藥物敏感性上均發(fā)揮著作用。GfsC同樣為新發(fā)現(xiàn)的半乳糖呋喃糖基轉(zhuǎn)移酶，和GfsA具有相同的功能，在煙曲霉形態(tài)、細(xì)胞表面的疏水性、藥物敏感性及毒力發(fā)揮不可或缺的作用[53]。

此外，某些蛋白酶上也存在糖基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉木聚糖酶(Af-XYNA)具有三個(gè)N -糖基化位點(diǎn)(N87、N124和N335)。木聚糖酶經(jīng)過(guò)N-糖基化修飾后，呈現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性(可以在60℃保持活性)。通過(guò)去糖基化酶及N124位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)去糖基化的木聚糖酶活性降低、pH的適應(yīng)范圍變小[25]。

4 其 他

煙曲霉中還存在其他許多不同種類的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對(duì)煙曲霉的生長(zhǎng)、次生代謝物、形態(tài)及藥物敏感性等過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，如甲基化、棕櫚?；?、異戊烯化、法尼基化等修飾。

蛋白質(zhì)甲基化修飾在煙曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。唑類藥物通過(guò)抑制14-a-去甲基酶(Erg11)，從而導(dǎo)致14-a-甲基化甾醇累積，細(xì)胞膜的通透性改變，煙曲霉死亡[27]，可見去甲基化在麥角甾醇合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。CclA為煙曲霉H3L4復(fù)合體(組蛋白3賴氨酸4)的甲基化酶，敲除cclA時(shí)，H3L4失去甲基化，煙曲霉生長(zhǎng)受到抑制，但次生代謝物膠霉毒素增多[28]。

Ras是膜連接的GTP酶，可以激活信號(hào)傳導(dǎo)通路。煙曲霉中鑒定出兩種Ras酶，分別為RasA、RasB，這兩種Ras蛋白調(diào)控著真菌生長(zhǎng)、形態(tài)及致病性[30]。Ras蛋白C-端棕櫚?；揎椏梢苑€(wěn)定其與細(xì)胞膜結(jié)合，促進(jìn)Ras蛋白在質(zhì)膜上的積累[54-55]。Ras蛋白經(jīng)過(guò)異戊烯化修飾后，疏水性增加，對(duì)膜表現(xiàn)出更高的親和力，并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。敲除法尼基轉(zhuǎn)移酶基因ramA，Ras蛋白的法尼基化修飾降低，RasA蛋白膜定位量減少，煙曲霉的生長(zhǎng)、毒力受到抑制，對(duì)唑類藥物的耐藥性增強(qiáng)[56]。

此外，在煙曲霉中，還發(fā)現(xiàn)存在泛素化、SUMO化等不同的翻譯后修飾[6]，這些修飾可能在煙曲霉形態(tài)、毒力及藥物敏感等過(guò)程中均發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。

5 展 望

翻譯后修飾參與多種生理過(guò)程，調(diào)控著煙曲霉的形態(tài)、毒力及藥物敏感性等。煙曲霉耐藥率逐年升高，促使我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)來(lái)改變這一現(xiàn)象。翻譯后修飾參與煙曲霉多個(gè)生理過(guò)程，可作為未來(lái)新型抗真菌藥物的潛在研究靶點(diǎn)。其次，關(guān)于煙曲霉翻譯后修飾的研究局限于單個(gè)蛋白的單一修飾，很多蛋白存在多種修飾，且煙曲霉各種生理過(guò)程間存在相關(guān)性，不同的修飾間必然也存在相關(guān)作用關(guān)系。為了揭示煙曲霉復(fù)雜生理過(guò)程，應(yīng)聯(lián)合多種翻譯后修飾來(lái)了解其作用機(jī)制。