刺五加和短梗五加葉片初生代謝的發(fā)育特異性調(diào)控研究

宋 瑩 吳可心 邵文達(dá) 劉昱利 劉 佳 劉 洋 唐中華*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；3. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150040）

刺 五 加（（Rupr. Max‐im.）Harms，）、短梗五加（（Rupr. et Maxim.）Seem，）均為五加科（Araliaceae）五加屬（）植物，是東北地區(qū)五加科僅有的兩種同屬藥用植物，均屬落葉灌木植物，常叢生或散生于針闊葉混交林或闊葉林中。刺五加在中國作為中藥材廣泛應(yīng)用已有悠久的歷史，其根和根莖可入藥為五加皮，并被記入中華人民共和國藥典，具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，短梗五加在藥理方面也有相似作用。

目前，刺五加野生資源匱乏，但對其需求卻日益增大。為了保護(hù)刺五加野生資源，滿足市場需求，中國、韓國、日本等國家自90 年代初就進(jìn)行了刺五加人工栽培技術(shù)的研究，但至今人工栽培體系仍不完善，因此要采取更合理精準(zhǔn)的栽培方法，并尋找新的替代品。有研究表明在短梗五加的根、莖、葉中檢測到多種藥用成分，且與刺五加相比，短梗五加的根和枝中一些成分含量要高于刺五加，如蘆丁、山奈酚等。通過毒性實驗，發(fā)現(xiàn)這些代謝物無細(xì)胞毒性，因此短梗五加的根皮可入藥，葉片也具有食用價值。深入研究刺五加和短梗五加的藥用成分具有重要的應(yīng)用前景。目前對刺五加和短梗五加的藥用成分研究較多，但對刺五加和短梗五加的不同發(fā)育時期的初生代謝物差異研究較少。

植物代謝組學(xué)技術(shù)有全面的定性或定量研究植物內(nèi)源代謝物質(zhì)的特點，通過對植物體內(nèi)大分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，解析植物生命周期的代謝途徑，進(jìn)而揭示植物生命活動的奧秘。植物初級代謝是通過合成代謝和分解代謝生成維持生命活動的能量和物質(zhì)的過程。利用植物代謝組學(xué)技術(shù)對兩種植物的初級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，為兩種植物的生產(chǎn)應(yīng)用提供更多可能性。我們先前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺五加和短梗五加的藥用活性成分在不同組織部位的積累水平不同，其采收最佳年限為3～5 年，在達(dá)到最佳年限后，采收時期也尤為重要，在最佳采收時期收獲能有效提高刺五加和短梗五加產(chǎn)品的質(zhì)量和利用率。但目前還鮮見對刺五加和短梗五加葉片中的初級代謝物隨季節(jié)動態(tài)變化積累的相關(guān)研究。

在對刺五加和短梗五加長期跟蹤和調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，刺五加和短梗五加自5 月上旬萌芽，7 月上旬進(jìn)入生長生殖階段，且葉片數(shù)目不再增加。本研究通過對不同時期刺五加和短梗五加葉片中的初級代謝產(chǎn)物的檢測和3 個時期差異代謝物的篩選，確定葉片不同時期化學(xué)成分的積累模式，為提高刺五加和短梗五加葉片利用率、葉片藥用采收和食用采摘提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用實驗材料均來自于東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院溫室內(nèi)栽培的3 年生刺五加和短梗五加（經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)穆立薔教授鑒定）。2019 年5～10 月的每月中旬采集刺五加和短梗五加距植株頂端20 cm 處的各1 對葉片，每種植物采集3個生物學(xué)重復(fù)，樣品沖洗干凈后經(jīng)液氮速凍并放入-80 ℃冰箱備用。

1.2 樣品制備

1.2.1 待測樣品制備

分別稱取刺五加和短梗五加葉片樣品90 mg，放入2 mL 的離心管中，加入540 μL 的冷甲醇和60μL的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL，質(zhì)譜級甲醇配制），放入高通量組織研磨儀（Xinyi-24，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）中60 Hz 研磨2 min后取出，繼續(xù)超聲提取30 min，加入300 μL 的氯仿，渦旋（20 Hz）2 min，加入600 μL 的去離子水后再次渦旋2 min，超聲提取30 min，4 ℃條件下14 000 r·min離心10 min。取700μL 上清液裝入玻璃衍生瓶中，用真空離心濃縮儀（LSE-3K，常州金壇良友儀器有限公司）揮干，加入400μL的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg·mL）并渦旋震蕩2 min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37 ℃肟化反應(yīng)90 min，取出后再加入400μL的BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑和60μL的正己烷，渦旋震蕩2 min，于70 ℃條件下反應(yīng)60 min。反應(yīng)完畢后取出樣品，室溫放置30 min后進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.2.2 GC-MS分析條件及數(shù)據(jù)處理

使用7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agi‐lent，USA）作為本實驗的分析儀器，1μL 衍生化后的葉片提取物用無分流模式注入儀器系統(tǒng)，樣品經(jīng)過非極性的DB-SMS 毛細(xì)管柱（30 m × 250μm I.D.，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）經(jīng)過分離后進(jìn)入質(zhì)譜。載氣為高純氦氣（流速1.0 mL·min）。始GC溫度為60 ℃，隨后柱箱溫度以8 ℃/min 的升至125 ℃，以4 ℃/min 升至210 ℃，以5 ℃/min 升至270 ℃，以10 ℃/min升至305 ℃，保持3分鐘。電子轟擊（EI）離子源保持在260 ℃，電壓：-70 V，質(zhì)量范圍為50～600 m·z，在MS 設(shè)置下數(shù)據(jù)采集率為20光譜/秒。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用數(shù)據(jù)分析軟件（Agilent GC-MS 5975）處理，并采用XCMS 軟件包下進(jìn)行數(shù)據(jù)的特征峰提取和預(yù)處理，將預(yù)處理完畢的數(shù)據(jù)矩陣歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P（version 13，Umet-rics，Umea，瑞典）軟件進(jìn)行PCA 分析和OPLS-DA 等多元統(tǒng)計分析。再依據(jù)變量對分組貢獻(xiàn)得分（VIP 得分）大于1 和組間變化的差異檢驗（-test）顯著性（<0.05）為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異代謝物，并將其輸入到kegg數(shù)據(jù)庫和Metabo Analyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝途徑的富集和篩選。

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及歸一化處理。采用單因素方差分析（one-way ANOVA)，差異顯著性<0.05，確定各時期的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺五加和短梗五加葉片PCA 和OPLS-DA模型的分析

對GC-MS 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，在刺五加和短梗五加植物樣品中共掃描到134個色譜峰，根據(jù)色譜峰的保留時間等信息在NIST 數(shù)據(jù)庫和Wiley Registry 代謝組數(shù)據(jù)庫對檢測到的色譜峰定性注釋，在刺五加和短梗五加中都定性出了大量代謝產(chǎn)物。

為了分析刺五加和短梗五加兩物種葉片初級代謝產(chǎn)物在5～10 月的差異性，分別對代謝產(chǎn)物進(jìn)行最小二乘法和主成分分析，得到了2 個PCA 模型，累積刺五加=0.399，=0.244，短梗五加=0.413，=0.322。從圖1中可以看出所有樣品均處在置信區(qū)間內(nèi)，但PCA效果不明顯。2個品種進(jìn)行OPLS-DA 分析后，分別得到2 個主成分，刺五加=0.271，=0.265，=0.386，短 梗 五 加=0.202，=0.195，=0.322，3 個參數(shù)值相接近，OPLS-DA 模型可信度較PCA 模型更高（見圖2）?？梢钥闯? 個品種檢測到的化合物分別在5～6 月份聚集，7～8 月份聚集，9～10 月份聚集，因此將5～10 這6 個月份分為3 個時期，即5～6 月份的葉片開始伸展生長時期（生長期Growth period，G），7～8 月份葉片開始積累和轉(zhuǎn)化有用成分時期（旺盛期Ex‐uberant period，E），9～10 月份葉片開始枯黃脫落時期（凋落期Autumn period，A）。

圖1 刺五加、短梗五加葉片PCA得分圖A.刺五加；B.短梗五加Fig.1 PCA score of A.senticosus and A.sessiliflorusA.A.senticosus；B.A.sessiliflorus

圖2 刺五加、短梗五加葉片OPLS-DA得分圖A.刺五加；B.短梗五加；1.5月；2.6月；3.7月；4.8月；5.9月；6.10月Fig.2 OPLS-DA score of A.senticosus and A.sessiliflorusA.A.senticosus；B.A.sessiliflorus；1.In May；2.In June；3.In July；4.In August；5.In September；6.October

2.2 刺五加和短梗五加葉片樣品差異代謝物的篩選

進(jìn)一步利用OPLS-DA 模型的VIP 值（VIP>1）和檢驗（-test）的值（閾值<0.05）來篩選刺五加和短梗五加在3 個發(fā)育時期的差異化合物。如表1 所示，在刺五加中篩選出42 個差異化合物，其中糖類化合物8 種，氨基酸類化合物5 種，有機(jī)酸類化合物10 種，醇類化合物4 種，脂肪酸類化合物2種，其它化合物13 種；在短梗五加中篩選出48 個差異化合物，其中糖類化合物11種，氨基酸類化合物6 種，有機(jī)酸類化合物8 種，醇類化合物4 種，脂肪酸類1種，其它化合物18種。

表1 刺五加和短梗五加葉片3個時期差異化合物定性結(jié)果Table 1 Qualitative results of different compounds in leaves of A.senticosus and A.sessiliflorus at three stages

續(xù)表1 Continued table 1

2.3 刺五加和短梗五加葉片在3個時期的差異化合物聚類分析

對檢測出的刺五加和短梗五加的差異化合物進(jìn)行最小二乘法和聚類分析，累積2 個OPLS-DA模型，刺五加3 個時期間有顯著差異（見圖3）；短梗五加3個時期也區(qū)分開來（見圖4）。由圖3～4可知刺五加和短梗五加3個時期有顯著區(qū)分，因此將刺五加和短梗五加3 個時期的差異化合物分別篩選，做聚類分析。圖5 可知，刺五加葉片中差異化合物在3個時期有不同積累，在葉片生長期積累的主要化合物是肌醇和甘油，在旺盛期主要積累的是奎寧酸、苯甲酸、塔羅糖、尿素及烷類、酯類物質(zhì)，在葉片凋落期主要積累的是可溶性糖、多糖、L-苯丙氨酸及一些烷類化合物。而蘋果酸、丁二酸、孜然醇、甲酸酯、正丁胺等化合物在葉片生長的旺盛期和凋落期都有積累。由圖6可知，短梗五加葉片的差異化合物在3個時期也有明顯的積累，更多集中在葉片生長的旺盛期和凋落期，在生長期積累較少。短梗五加在葉片生長期積累了葡萄糖、丁烯二酸和半乳糖肟，在葉片旺盛期主要積累了異喹啉、蔗糖、阿拉伯呋喃糖、苯酚、有機(jī)酸、甘油酯、孜然醇及一些烷類化合物，在葉片凋落期積累糖類、氨基丁酸、多胺、間苯二甲酸、三硅氧烷、五硅氧烷及一些酯類和酮、膦類化合物。

圖3 刺五加3個時期葉片OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score of A.senticosus in three stages

圖4 短梗五加3個時期葉片OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA score of A.senticosus in three stages

圖5 刺五加三個時期差異代謝物聚類分析G.生長期；E.旺盛期；A.凋落期；下同F(xiàn)ig.5 Cluster analysis of different metabolites of A.senticosus in three periodsG.Growth period；E.Exuberant period；A.Autumn period；The same as below

圖6 短梗五加三個時期差異代謝物聚類分析Fig.6 Cluster analysis of different metabolites of A.sessiliflorus in three periods

對刺五加和短梗五加3 個時期主要代表的差異化合物的相對含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2～3所示。在刺五加中糖類在葉片生長期和凋落期積累較多，而氨基酸類物質(zhì)在葉片旺盛期和凋落期積累較多，甘油、醇類物質(zhì)在葉片生長期開始積累。在短梗五加中，葡萄糖在葉片生長期積累，阿拉伯呋喃糖和尿素在葉片生旺盛期積累最多，果糖、龍膽糖和甘露糖在葉片凋落期積累最多，蔗糖在3個時期均有積累，而苯酚在葉片旺盛期積累。

表2 刺五加葉片3個時期主要代謝物峰面積差異方差分析Table 2 Variance analysis of peak area difference of main metabolites in leaves of A. senticosus at three stages

3 討論

表3 短梗五加葉片3個時期主要代謝物峰面積差異方差分析Table 3 Variance analysis of peak area difference of main metabolites in leaves of A. sessiliflorus at three stages

刺五加和短梗五加研究較多的是根、根皮、莖皮中的藥用活性成分，但對食用價值方面的報道很少。本研究采用GC-MS 對刺五加和短梗五加5～10 月份葉片中的化合物進(jìn)行檢測，篩選主要的差異代謝物，揭示刺五加和短梗五加葉片生長過程中的初級代謝機(jī)制。刺五加中篩選出53個差異化合物，經(jīng)過PCA、OPLS-DA、聚類等分析發(fā)現(xiàn)，刺五加葉片生長期主要積累甘油、肌醇類化合物。甘油酯類化合物是植物細(xì)胞組織和器官保護(hù)膜的主要組成部分，是發(fā)育、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號和抵抗逆境的重要因子。甘油酯也能為植物萌發(fā)和代謝提供能量，刺五加葉片的生長期需要大量的能量供應(yīng)，所以甘油類物質(zhì)積累較多。在葉片生長旺盛期奎寧酸、苯甲酸、塔羅糖及酸類酯類等物質(zhì)積累。刺五加葉片中奎寧酸在生長期開始積累，到旺盛期達(dá)到最多，而后凋落期分解，奎寧酸是一些高等植物特有的有機(jī)酸，作為合成芳香族氨基酸的前體物質(zhì)，在葉片凋落期調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)大量合成，旺盛期積累的奎寧酸被消耗，所以含量減少。苯甲酸類化合物容易被植物吸收，且能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，延緩植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分解，所在葉片生長旺盛期積累了大量苯甲酸，促進(jìn)葉片的生長發(fā)育。在葉片凋落期糖類、蘋果酸和醇類有較多積累。糖類化合物不僅為植物生命活動提供能量，而且作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在植物整個生命周期內(nèi)發(fā)揮重要作用。蘋果酸和苯甲酸也是常見的有機(jī)酸，在植物根、莖、葉中分布廣泛，有機(jī)酸參與植物光合和呼吸過程，合成酯類等物質(zhì)，增強(qiáng)植物抗逆性，因此在凋落期檢測到較多有機(jī)酸，是植物自身抵抗逆境的表現(xiàn)。

短梗五加差異代謝物在葉片中的積累時期多數(shù)同刺五加類似，不同的是短梗五加葉片在生長期葡萄糖積累增多；在葉片生長旺盛期異喹啉、二糖、苯酚、有機(jī)酸、甘油酯等化合物積累增多。其中異喹啉是生物堿類化合物的重要組成部分，其本身有鎮(zhèn)痛作用，合成的生物堿應(yīng)用于抗癌及治療心腦血管等疾病，目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有廣泛應(yīng)用。研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖等二糖在葉片生長期積累較少，在葉片旺盛期積累最多，在凋落期開始下降，這一結(jié)果與李永庚等研究冬小麥蔗糖淀粉的結(jié)果一致，在生長發(fā)芽期蔗糖開始積累，在植物開花時期積累最多，隨著果實成熟，植株衰敗，蔗糖隨之減少。在短梗五加葉片的凋落階段，正丁胺、尸胺等多胺類物質(zhì)也積累較多。多胺是某些動、植物的生長因子，但在受精和萌發(fā)過程中多胺會產(chǎn)生抑制作用，因此多胺類物質(zhì)的作用有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

基于GC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)，對刺五加和短梗五加5～10 月份葉片初級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了對比分析，結(jié)果顯示，刺五加積累的化合物主要是果糖、苯甲酸等，短梗五加積累的主要是葡萄糖、甘露糖、尿素等。刺五加葉片在葉片旺盛期和凋落期差異化合物積累最多，主要是糖類、有機(jī)酸；短梗五加葉片同樣是在葉片旺盛期和凋落期積累化合物最多，但主要是糖類、有機(jī)酸、脂肪酸、多胺類化合物。綜上所述，基于GC-MS技術(shù)、結(jié)合多元化的統(tǒng)計分析方法，對檢測刺五加和短梗五加葉片初級代謝產(chǎn)物季節(jié)動態(tài)具有一定可行性，可以為刺五加、短梗五加不同時期葉片采摘及藥用、食用提供一定的理論基礎(chǔ)。