熱應(yīng)激對(duì)反芻動(dòng)物乳中脂肪酸合成的影響及其機(jī)制

曾 佳 徐連彬 張 晨 劉紅云

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058)

隨著全球氣候變暖，動(dòng)物在夏季高溫天氣容易發(fā)生急性或慢性持續(xù)熱應(yīng)激(heat stress，HS)。HS會(huì)引起反芻動(dòng)物體溫升高、呼吸頻率增加、體溫調(diào)節(jié)能力失衡，導(dǎo)致機(jī)體代謝改變、瘤胃酸中毒和能量負(fù)平衡等系列問(wèn)題，進(jìn)而影響動(dòng)物的繁殖和泌乳性能，并對(duì)奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。溫度濕度指數(shù)(temperature humidity index，THI)是反映動(dòng)物HS水平的重要指標(biāo)。隨著THI的升高，奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白和乳脂含量均下降[2]。當(dāng)THI>72時(shí)，反芻動(dòng)物因無(wú)法維持機(jī)體熱平衡而發(fā)生HS，使得干物質(zhì)攝入量(dry matter intake，DMI)和產(chǎn)奶量降低，并影響動(dòng)物的健康狀況[3]。乳脂作為乳中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是衡量生鮮乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前，HS對(duì)反芻動(dòng)物乳脂合成及乳中脂肪酸組成影響的研究主要集中于生產(chǎn)試驗(yàn)，具體作用機(jī)理尚不清楚，并且大多數(shù)HS試驗(yàn)集中在慢性HS對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響，急性HS方面的研究更少。因此，本文圍繞HS對(duì)乳中脂肪酸含量和組成的影響機(jī)制，從乳中脂肪酸的來(lái)源、代謝過(guò)程及乳腺乳合成能力等方面進(jìn)行綜述，為開(kāi)發(fā)緩解HS的飼料添加劑提供理論依據(jù)，并有利于通過(guò)優(yōu)化反芻動(dòng)物飼糧配比實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)飼喂。

1 乳中脂肪酸組成

乳脂是反芻動(dòng)物主要乳成分之一，乳脂的含量與組成直接影響乳制品的風(fēng)味及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳脂由98%～99%甘油三酯(triglycerides，TG)、0.2%～1.0%磷脂、0.25%～0.40%甾醇等成分組成[4]。其中，TG由1個(gè)甘油分子即丙三醇和3個(gè)脂肪酸分子組成，主要以脂肪球形式存在[5]。乳制品的脂肪酸是人體必需脂肪酸和多種不飽和脂肪酸的重要來(lái)源[6]。乳制品中含有豐富的共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)，CLA的同分異構(gòu)體c9,t11-CLA具有較好的抑制腫瘤效果[7]。二十二碳六烯酸(C22∶6 n-3，DHA)和花生四烯酸(C20∶4 n-6，AA)是乳中主要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。在人體中，DHA和AA是細(xì)胞膜的基本組成成分，在神經(jīng)突觸生長(zhǎng)和信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，并對(duì)嬰兒早期視覺(jué)和認(rèn)知發(fā)育具有重要意義[8]。此外，乳脂中還含有亞麻油酸、亞油酸等多種易被人體消化吸收且對(duì)人類營(yíng)養(yǎng)和健康有益的功能性物質(zhì)。

2 HS影響乳中脂肪酸組成

HS可引起奶牛產(chǎn)奶量、乳蛋白和乳脂產(chǎn)量下降[9-10]。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)分析乳中的脂質(zhì)成分顯示，HS使乳中TG和極性脂質(zhì)發(fā)生顯著變化，其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰膽堿(下降最大)和葡萄糖神經(jīng)酰胺等多種極性脂質(zhì)的豐度降低[5]。

2.1 對(duì)乳中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)與長(zhǎng)鏈脂肪酸(long-chain fatty acid, LCFA)組成的影響

根據(jù)碳鏈的長(zhǎng)短可將脂肪酸分為L(zhǎng)CFA、中鏈脂肪酸(middle-chain fatty acid, MCFA)和SCFA[4]。SCFA是厭氧腸道微生物群發(fā)酵膳食纖維的最終產(chǎn)物，已被證明對(duì)哺乳動(dòng)物能量代謝具有多種有益作用[11]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HS時(shí)乳中SCFA和MCFA含量減少，LCFA含量增加，表明乳腺脂肪酸合成受到HS的調(diào)控。引起LCFA含量增加的可能原因是體脂肪的熔點(diǎn)與機(jī)體溫度存在正相關(guān)，即較高的機(jī)體溫度與較高的脂肪溶解溫度相關(guān)[1]。相比SCFA，LCFA具有更高的溶解溫度，HS時(shí)LCFA含量的改變可能是一種生化適應(yīng)過(guò)程，即提高脂肪降解溫度以對(duì)抗機(jī)體溫度的增加。

2.2 HS對(duì)乳中飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)與不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)組成的影響

根據(jù)碳鏈中是否具有雙鍵可將脂肪酸分為SFA和UFA，其中含有1個(gè)雙鍵的為單不飽和脂肪酸(mono-unsaturated fatty acids, MUFA)，含有2個(gè)或2個(gè)以上雙鍵的為多不飽和脂肪酸(poly unsaturated fatty acid, PUFA)[4]。HS會(huì)影響乳中SFA與UFA的組成，但目前研究結(jié)果并不一致。Hammami等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)奶牛在遭受HS時(shí)，隨THI增加，UFA、MUFA、PUFA、LCFA含量分別增加了4.2%、4.0%、6.1%、5.3%；相反，Wang等[10]對(duì)夏季乳脂肪酸組成的分析發(fā)現(xiàn)，UFA含量顯著降低，尤其是長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸。李征等[13]的研究表明，HS組乳中總飽和脂肪酸的含量顯著升高，總不飽和脂肪酸和C18∶1的含量顯著下降。引起脂肪酸含量變化的可能原因是當(dāng)機(jī)體處于HS狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞代謝加速，呼吸作用增強(qiáng)，體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧[14]。在正常情況下，由機(jī)體代謝產(chǎn)生的氧自由基能夠被機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中和，但在HS時(shí)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基不能被及時(shí)清除，導(dǎo)致氧自由基的積累而氧化UFA(特別是PUFA)，從而導(dǎo)致乳中UFA的含量減少，SFA的含量增加[15]。

2.3 急性、慢性HS對(duì)乳中脂肪酸組成的影響

生物的應(yīng)激反應(yīng)分為急性和慢性階段。急性反應(yīng)由神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)，一般持續(xù)數(shù)小時(shí)至數(shù)天；慢性反應(yīng)由內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，這2種反應(yīng)均涉及能量平衡和新陳代謝的改變[16]。不同的試驗(yàn)處理，HS對(duì)乳中脂肪酸組成的影響結(jié)果并不一致。Penev等[17]研究表明，HS時(shí)奶牛乳中MUFA的含量增加，而Wang等[10]、李征等[13]報(bào)道HS降低奶牛乳中UFA含量。Papaloukas等[18]報(bào)道，夏季HS綿羊乳中C18∶1含量增加，而李征等[13]研究結(jié)果表明，HS時(shí)奶牛乳中C18∶1含量降低。以上研究結(jié)果的不一致可能與牛、羊?qū)S耐受性及試驗(yàn)條件的不同有關(guān)。Hou等[19]開(kāi)展的不同HS處理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與3 d急性HS相比，持續(xù)7 d的HS導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低17.2%，DMI下降12.6%；此外，7 d的HS組乳蛋白含量、乳蛋白產(chǎn)量、瘤胃揮發(fā)性脂肪酸含量、非酯化脂肪酸含量分別下降6.8%、22.4%、29.7%、13.6%。張磊[4]研究表明，急性HS(3 d)顯著降低了奶牛瘤胃內(nèi)容物C18∶2n-6和總C18∶2的比例，中度HS(79

3 HS影響乳中脂肪酸合成的分子機(jī)制

飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大部分在瘤胃和小腸中消化吸收，之后經(jīng)過(guò)肝臟、血液循環(huán)周轉(zhuǎn)，在乳腺上皮細(xì)胞中合成乳成分。在這復(fù)雜的生理過(guò)程中，任何代謝物質(zhì)的改變均可能影響乳中脂肪酸前體物質(zhì)的供給。此外，乳腺組織中脂肪酸合成能力及機(jī)體內(nèi)分泌相關(guān)激素對(duì)乳腺乳合成的調(diào)控也可能影響乳中脂肪酸組成。

3.1 通過(guò)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響乳中脂肪酸合成

機(jī)體在HS狀態(tài)下通過(guò)內(nèi)分泌系統(tǒng)和信號(hào)蛋白等對(duì)應(yīng)激做出響應(yīng)[20]。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)通過(guò)激素或生長(zhǎng)因子作用于瘤胃、小腸、肝臟和乳腺等受體器官，激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起泌乳相關(guān)基因的表達(dá)變化，從而調(diào)控乳成分合成代謝。HS不僅影響激素的表達(dá)也會(huì)影響催乳素(prolactin，PRL)和雌激素等激素受體的表達(dá)[21]。Hooper等[22]研究表明，薩能奶山羊妊娠后期HS導(dǎo)致乳腺中PRL受體蛋白基因的表達(dá)降低。課題組前期的研究表明，HS可能通過(guò)下丘腦-垂體-乳腺軸相關(guān)激素影響小鼠的泌乳性能[23]。奶牛發(fā)生HS時(shí)，與乳合成代謝相關(guān)的激素水平發(fā)生改變，進(jìn)而可能影響乳腺細(xì)胞脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，并最終影響奶牛的泌乳性能[24]。HS使奶牛血漿中PRL含量提高，PRL可激活蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(JAK2/STAT5)信號(hào)通路，抑制脂肪生成，促進(jìn)脂肪組織中TG的脂解，為乳脂合成提供游離脂肪酸(又稱非酯化脂肪酸，non-esterified fatty acids，NEFA)等前體物[25]。但目前HS對(duì)內(nèi)分泌的影響還缺乏系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)，研究主要集中于激素對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持、氧化應(yīng)激與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面，對(duì)激素參與的物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)及乳中脂肪酸合成調(diào)控的具體機(jī)制還需深入研究。

3.2 通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)影響乳中脂肪酸合成

乳脂中大多數(shù)C4∶0至C14∶0和近1/2的C16∶0是由乳腺上皮細(xì)胞利用循環(huán)血液中的乙酸和β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHBA)從頭合成[26]。除了乳腺直接合成的脂肪酸外，反芻動(dòng)物乳脂中接近1/2的C16∶0和全部C18∶0以上的脂肪酸來(lái)自乳腺組織吸收的瘤胃代謝或體脂分解產(chǎn)生的脂肪酸[27]。HS狀態(tài)下奶牛DMI的下降，不僅可以降低產(chǎn)熱，還會(huì)降低瘤胃中乙酸生成，減少乳腺中脂肪酸的供給。血液中的脂類物質(zhì)部分來(lái)源于飼糧中消化吸收的脂肪，其中TG主要借助極低密度脂蛋白和乳糜微粒被運(yùn)輸至乳腺，經(jīng)毛細(xì)血管內(nèi)皮表面的脂蛋白水解酶水解為NEFA，然后被乳腺上皮細(xì)胞吸收并參與乳脂合成[6]。乳腺血流量也是影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的另一重要因素。Lough等[28]研究表明，HS降低奶牛乳腺血流量。此外，HS也會(huì)影響血液中與脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá)。先前的研究表明，HS奶牛血液熱休克蛋白含量增加，血液中參與LCFA羥基化的脂酰輔酶A硫脂酶7(acyl-CoA thioesteras 7，ACOT7)、參與脂肪酸β氧化的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1C(carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C)和調(diào)節(jié)脂肪酸合成的轉(zhuǎn)錄活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)表達(dá)上調(diào)，而Ras相關(guān)的C3肉毒毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)、細(xì)胞分裂周期蛋白42 (celldivisioncycle 42，CDC42)和AMP激活蛋白激酶Β2(recombinant protein kinase B2，PRKAB2)等調(diào)節(jié)參與脂肪酸從頭生物合成的關(guān)鍵酶表達(dá)下調(diào)[29]。因此，HS可能通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)影響脂肪酸合成前體物的供給、乳腺血流量、血液中物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)等，進(jìn)而影響乳中脂肪酸合成。

3.3 通過(guò)改變瘤胃發(fā)酵影響乳中脂肪酸合成

除了飼糧消化吸收生成的脂肪酸外，乳脂中的奇數(shù)和支鏈脂肪酸主要來(lái)源于瘤胃微生物的合成[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物瘤胃液中脂肪酸的組成受HS的影響。HS造成奶牛瘤胃液中C18∶2及C18∶2n-6的比例顯著減少，C18∶0的比例有增加趨勢(shì)，乳中SMCFA和c9,t11-CLA含量下降可能分別與瘤胃乙酸和BHBA的含量減少及乳腺△9-去飽和酶活性的降低有關(guān)[4]。C18∶2n-6不僅是C18脂肪酸合成的基礎(chǔ)，也能在瘤胃中經(jīng)過(guò)氫化反應(yīng)生成c9,t11-CLA[31]。HS可以破壞瘤胃黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，使瘤胃黏膜通透性增加，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系改變，從而影響揮發(fā)性脂肪酸的吸收[32]。此外，瘤胃微生物對(duì)瘤胃發(fā)酵、飼料纖維降解十分重要，瘤胃中微生物組成的變化是HS影響瘤胃脂肪酸生成的重要原因。HS影響肉牛的瘤胃微生物區(qū)系和某些有機(jī)酸(HS組異丁酸含量最高，達(dá)4.32 mmol/L)的含量，瘤胃中黃桿菌屬(Flavonifractor)、密螺旋體屬(Treponema)、瘤胃球菌屬 (Ruminococcus)的相對(duì)豐度分別降低1.4%、0.6%、0.9%[33]。Zhao等[34]研究證實(shí)，HS奶牛利用可溶性碳水化合物作為能量來(lái)源的細(xì)菌的相對(duì)豐度會(huì)發(fā)生明顯改變，產(chǎn)乳酸菌屬(Streptococcus)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、密螺旋體屬(Treponema)的相對(duì)豐度顯著升高；醋酸生成菌屬(Acetobacter)相對(duì)豐度降低。Jami等[35]研究表明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的比例與乳脂率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)與共軛亞油酸等脂肪酸的生成相關(guān)[36]。因此，HS可能通過(guò)改變瘤胃發(fā)酵影響乳中脂肪酸合成。

3.4 通過(guò)肝臟代謝影響乳中脂肪酸合成

肝臟是連接消化吸收與外周組織代謝的重要內(nèi)臟器官，可對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收變化做出響應(yīng)，并顯著改變代謝后的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)構(gòu)成[37]。肝臟對(duì)脂類的代謝涉及脂肪酸氧化、酮體生成、膽固醇及膽汁酸等衍生物合成、脂蛋白分泌、載脂蛋白和磷脂合成等過(guò)程[7]。HS降低了泌乳早期奶牛肝臟中過(guò)氧化物酶體脂肪酸β-氧化并減少ATP產(chǎn)生[38]，說(shuō)明HS影響了肝臟脂肪酸合成相關(guān)多種酶的活性。蛋白組學(xué)結(jié)果表明，HS導(dǎo)致奶牛線粒體功能受損，肝臟脂質(zhì)代謝改變[39]。Fan等[40]代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HS奶牛肝臟中乙酰乙酸和BHBA含量增加，表明NEFA的β-氧化增強(qiáng)，以滿足機(jī)體能量需求。上述研究說(shuō)明，HS影響了肝臟代謝，從而可能對(duì)乳脂肪酸合成的前體物產(chǎn)生影響，進(jìn)而可能影響乳脂肪酸的合成。因此，HS可能通過(guò)影響肝臟組織中多種酶的活性、肝臟細(xì)胞線粒體功能，影響乳腺組織吸收的脂肪酸前體物的組成，進(jìn)而影響乳腺脂肪酸的合成。之后的研究可以從HS影響肝臟代謝的角度，深入研究其對(duì)乳腺脂肪酸合成的影響。

3.5 HS通過(guò)乳腺代謝影響乳中脂肪酸的合成

乳腺是乳脂合成與分泌的主要場(chǎng)所，乳腺選擇性地從血液中攝取乳脂合成前體物，通過(guò)脂肪酸的從頭合成、去飽和作用等合成TG，在乳腺上皮細(xì)胞中合成乳脂，最后以乳脂小球的形式從乳腺細(xì)胞中分泌出去[41]。

3.5.1 HS對(duì)乳腺結(jié)構(gòu)和功能的影響

HS破壞乳腺上皮屏障的完整性，影響乳腺上皮細(xì)胞的緊密連接和代謝，引發(fā)乳腺細(xì)胞的熱休克反應(yīng)，從而對(duì)乳合成產(chǎn)生影響[1]。干奶期HS導(dǎo)致奶牛乳腺腺泡數(shù)量減少，結(jié)締組織增多[42]，并通過(guò)影響乳腺細(xì)胞凋亡和自噬活性，減少乳腺細(xì)胞增殖、減緩乳腺退化，從而導(dǎo)致下一泌乳期產(chǎn)奶量改變[1]。Hooper等[22]研究表明，妊娠后期HS導(dǎo)致薩能奶山羊乳腺細(xì)胞凋亡相關(guān)基因：腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associatal X protein,BAX)基因的表達(dá)升高，還通過(guò)破壞線粒體裂變和融合的平衡導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞功能障礙[43]，從而影響乳脂合成。此外，HS可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[44]。因此，HS可能通過(guò)影響乳腺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能等，影響乳腺上皮細(xì)胞的活性和物質(zhì)合成，進(jìn)而影響脂肪酸的合成和代謝。然而，HS在體內(nèi)影響乳腺上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入、基因表達(dá)及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的具體機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

3.5.2 HS對(duì)乳腺基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響

奶牛乳腺上皮細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞和機(jī)體的代謝對(duì)HS做出反應(yīng)。Li等[45]通過(guò)蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HS時(shí)乳腺細(xì)胞中的脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)表達(dá)量下降。FASN是脂肪酸生物合成的限速酶，乳中大多數(shù)的SMCFA主要通過(guò)FASN在乳腺中合成[46]。乳腺脂肪酸的合成受到過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor family，PPAR)家族、肝X受體家族及膽固醇應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1家族等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[47]。Gao等[48]通過(guò)RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，HS能夠降低乳腺組織代謝活動(dòng)(特別是碳水化合物和脂類代謝)，抑制PPAR表達(dá)。脂肪酸代謝具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄控制，mRNA和miRNA在調(diào)節(jié)乳腺脂肪酸代謝和乳脂合成中均起著重要作用。miR-497可通過(guò)LATS2基因調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞TG和UFA的產(chǎn)生[49]。Wang等[10]對(duì)HS奶牛乳腺的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，GO富集和KEGG通路富集到的基因主要與乳脂代謝相關(guān)，且鑒定出HS狀態(tài)下與CD36基因相關(guān)的circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。因此，HS可能通過(guò)乳中脂肪酸合成酶、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及miRNA影響乳中脂肪酸合成，具體分子機(jī)制有待更系統(tǒng)的研究。

4 小 結(jié)

熱應(yīng)激可能通過(guò)影響乳中脂肪酸合成前體物的供應(yīng)、物質(zhì)代謝過(guò)程和乳腺合成能力等調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物乳成分和乳中脂肪酸組成，進(jìn)而影響乳品質(zhì)。未來(lái)有必要進(jìn)一步探究熱應(yīng)激對(duì)乳腺組織乳脂合成前體物供應(yīng)、攝取、利用及代謝的影響，并深入研究其分子機(jī)制，應(yīng)用多組學(xué)等技術(shù)，系統(tǒng)闡明急慢性熱應(yīng)激狀態(tài)下乳中脂肪酸的合成代謝變化規(guī)律，及反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)瘤胃、肝臟、乳腺等多器官的協(xié)同響應(yīng)機(jī)制，以期為緩解熱應(yīng)激、提高乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)提供理論依據(jù)。