3D 生物打印的子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞生物支架用于宮腔粘連的探討

夏瑞琦，孔憲超

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）表現(xiàn)為月經(jīng)量減少、反復(fù)流產(chǎn)或不孕，發(fā)病率逐年上升，是育齡女性不孕癥的原因之一。IUA 的形成與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞所處的基底層損傷直接相關(guān)[1]，因此也被認(rèn)為是干細(xì)胞缺乏或功能障礙相關(guān)的疾病。Du 等[2]發(fā)現(xiàn)在急性損傷的子宮內(nèi)膜處可以出現(xiàn)干細(xì)胞募集現(xiàn)象，通過釋放細(xì)胞因子或其他機制體現(xiàn)一定的修復(fù)能力。但人體循環(huán)中自發(fā)募集的干細(xì)胞數(shù)量不足以在反復(fù)性和侵害性損傷處發(fā)揮有效的修復(fù)作用，這或許是IUA 沒有得到有效治療和控制的原因之一。近年來，組織工程、干細(xì)胞成為治療IUA 的研究熱點[3-5]。3D 打印與組織工程、干細(xì)胞相結(jié)合的3D 生物打印技術(shù)可以通過構(gòu)建生物支架打印所需細(xì)胞，在促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生、改善子宮內(nèi)膜纖維化方面取得了初步的研究成果，這一趨勢為許多具有突破性的治療方案提供了新思路。

1 3D 生物打印

3D 打?。╰hree-dimensional printing）技術(shù)又稱快速成型技術(shù)、自由成型技術(shù)等。3D 生物打印是3D 打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的交叉應(yīng)用，是一種添加劑制造（additive manufacturing，AM）的過程，在計算機輔助設(shè)計（computer aided design，CAD）系統(tǒng)的幫助下，以活細(xì)胞為印刷材料，根據(jù)假定的數(shù)字模型，逐層制作有活性和功能的三維組織和器官結(jié)構(gòu)。3D生物打印應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，可以滿足對適合移植組織和器官的需要。

1.1 圖像數(shù)據(jù)處理及建模3D 生物打印包括3 個步驟：①利用CAD、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）[6]形成目標(biāo)組織或器官的影像，將影像轉(zhuǎn)換為生物材料和細(xì)胞組成的異質(zhì)模型，隨后將特定的原型減少到一系列2D 層來重新創(chuàng)建3D 結(jié)構(gòu)。②印刷過程是利用計算機輔助的精密沉積技術(shù)，逐層同時沉積細(xì)胞和生物材料。③在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)印刷的組織結(jié)構(gòu)[7]。

1.2 3D生物打印的常見方式 第一臺“3D 打印機”是由Chuck Hull 設(shè)計的，受組織工程和再生醫(yī)學(xué)最新進(jìn)展的啟發(fā)，3D 打印已成功地用于組織生物制造[8]。根據(jù)工作原理，3D 生物打印技術(shù)可分為噴墨式生物打印、擠出式生物打印和激光輔助生物打印等。具體情況見表1 和圖1[8-11]。

圖1 3 種3D 生物打印技術(shù)的示意圖[11]

表1 3 種3D 生物打印技術(shù)的對比

1.2.1 噴墨式生物打印噴墨式打印是最早的3D生物打印技術(shù)，原理與傳統(tǒng)的2D 噴墨打印類似，利用熱力或聲波的方法迫使細(xì)胞和生物材料以液滴的形式噴射到基板上，反復(fù)沉積形成所需的底物。噴墨生物打印可調(diào)節(jié)液滴的大小、沉積速率和位置，適用于形狀不規(guī)則或復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)[12]。其優(yōu)點包括打印速度快，成本低，可用性廣，細(xì)胞活性相對較高。Gao 等[13]使用改良的惠普（HP）噴墨打印機，在強聚（乙二醇）凝膠中運載人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，HMSC）和羥基磷灰石制造了骨狀組織。結(jié)果表明，打印后的細(xì)胞具有較高的活性。然而，噴墨生物打印的一個常見缺點是由于噴頭的驅(qū)動壓力較小，所以處理高黏性生物材料的能力有限，可能造成噴嘴堵塞。

1.2.2 擠出式生物打印在擠出式生物打印中，生物墨水在氣動壓力或機械（活塞或旋轉(zhuǎn)螺絲）驅(qū)動下，以線狀結(jié)構(gòu)連續(xù)從噴嘴尖端擠出至無菌基板上[7]。主要優(yōu)點是其分辨率高，能夠準(zhǔn)確地打印使用CAD 軟件設(shè)計的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，沉積較高密度的細(xì)胞且通常表現(xiàn)出更好的結(jié)構(gòu)完整性。缺點是封裝的細(xì)胞暴露在較大的應(yīng)力下，在打印期間降低了細(xì)胞的活性。隨著擠出壓力的增加和噴嘴直徑的減小，細(xì)胞活性降低。保持高活力是實現(xiàn)組織功能的關(guān)鍵，因此，必須仔細(xì)優(yōu)化打印參數(shù)，以確保打印細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1.2.3 激光輔助生物打印激光輔助生物打印是基于激光誘導(dǎo)前向轉(zhuǎn)移（laser-induced forward transfer，LIFT）原理的打印技術(shù)，以精度和微米分辨率打印不同的活細(xì)胞和生物材料。LIFT 裝置一般由激光源、靶板和接收基底構(gòu)成，該靶板由激光能量吸收層（例如金或鈦）和生物墨水涂層的透明基底（例如石英或玻璃）制成。聚焦的激光脈沖在靶板上產(chǎn)生一個高壓氣泡，將包含細(xì)胞的材料推向接收基底。激光輔助生物打印無噴嘴，避免了生物墨水堵塞噴嘴的問題。然而，激光對細(xì)胞的影響尚未得到充分的研究，高打印成本和激光打印控制系統(tǒng)的復(fù)雜性是該技術(shù)使用的另一個限制[14]。

1.3 生物墨水生物墨水是由以溶液或水凝膠形式的生物材料和所需細(xì)胞構(gòu)成。生物材料不僅應(yīng)具有適當(dāng)?shù)酿ざ?、較高的機械強度，還應(yīng)具備生物相容性強、免疫原性較低和可生物降解的特性。最重要的是，必須支持細(xì)胞附著、增殖和功能。目前用于修復(fù)和再生的生物材料主要是天然衍生的聚合物（包括從動物或人體組織中分離出來的海藻酸鈉、明膠、膠原、透明質(zhì)酸等）、合成分子（聚乙二醇、聚乳酸和聚己內(nèi)酯）或兩者的結(jié)合。天然聚合物在3D 生物打印中的優(yōu)勢是與人類細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相似，可生物降解且具有高度生物相容性，廣泛用于皮膚、心血管、骨骼、軟骨和胰島的再生，但機械強度較弱[15]，幾十年來，藻酸鹽和明膠在生物打印中得到了廣泛的應(yīng)用[16]，其打印的組織和細(xì)胞活性較高，是目前生物打印的良好材料；合成聚合物的優(yōu)點是可以根據(jù)特定的物理特性印刷所需的機械強度，挑戰(zhàn)包括生物相容性差、有毒降解產(chǎn)物和降解過程中機械性能的喪失，因阻礙細(xì)胞的增殖和分化，故實際應(yīng)用較少。

2 干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜再生中的應(yīng)用

人體干細(xì)胞是一組具有多向分化和自我更新潛能的未成熟原始細(xì)胞群，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，前者起源于胚泡，后者位于再生組織中。胚胎干細(xì)胞具有高度增殖能力，但也具有致瘤性。成體干細(xì)胞惡性潛能較低，因此常應(yīng)用于干細(xì)胞治療。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是中胚層早期發(fā)展中形成的多能成體干細(xì)胞，它們不僅具有強大的分化潛能和自我更新的能力，而且能夠遷移到受損組織和慢性炎癥區(qū)域來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（endomentrial mesenchymal stem cells，eMSC）已被證實存在于子宮內(nèi)膜基底層和血管周圍，可被招募到受傷區(qū)域修復(fù)組織。子宮內(nèi)膜在每一個月經(jīng)周期都會經(jīng)歷退化、細(xì)胞增殖、分化和再生的過程。子宮內(nèi)膜基底層的eMSC 表現(xiàn)出自我更新和多向分化的潛能，從而再生功能層。然而不幸的是，可以從子宮內(nèi)膜組織中分離的eMSC 的數(shù)量非常有限。

來自經(jīng)血、骨髓、臍帶血、脂肪組織和羊水的MSC 是治療宮腔粘連的研究熱點，子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞（endometrial regenerative cells，ERC）是目前治療宮腔粘連最受歡迎的間充質(zhì)干細(xì)胞[17]。2007 年Meng等[17]首次發(fā)現(xiàn)并報道了一種來源于人經(jīng)血的MSC。子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞是以簡單、無創(chuàng)的方式從人體排泄廢物——成熟女性月經(jīng)血中分離獲得的具有MSC特征的一類獨特細(xì)胞群，且體外增殖、遷移和促血管生成能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)來源的MSC，可作為eMSC的良好替代[18]。更重要的是，從患者本身獲得的ERC的移植被認(rèn)為是自體移植，不會引起免疫排斥。Tan等[19]成功培養(yǎng)了重度宮腔粘連患者的ERC 并進(jìn)行自體移植。結(jié)果顯示，移植后所有患者宮腔粘連帶數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜形態(tài)改善，子宮內(nèi)膜血流增加。有5 例患者子宮內(nèi)膜增厚至7 mm 足以接受胚胎種植，1 例移植2 個周期后自然妊娠并分娩。同時也有證據(jù)表明，在宮腔粘連區(qū)域移植干細(xì)胞可使子宮內(nèi)膜纖維區(qū)減少，腺體數(shù)量增加，刺激血管生成，增加子宮內(nèi)膜厚度[20]。血管和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的再生是評估子宮內(nèi)膜組織修復(fù)的重要指標(biāo)[21]。與傳統(tǒng)的治療方法相比，干細(xì)胞治療能夠幫助恢復(fù)宮腔功能，形成更好的組織結(jié)構(gòu)保護(hù)妊娠，提高妊娠率[20]。

在子宮中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞也非均來源于子宮，如骨髓來源干細(xì)胞（bone marrow-derived stem cells，BMDSC）、人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，HES）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPS）也參與子宮內(nèi)膜修復(fù)[22]。其中BMDSC在子宮內(nèi)膜的募集可能是對損傷或懷孕的修復(fù)性反應(yīng)，而不是月經(jīng)再生。Santamaria 等[23]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療宮腔粘連的臨床研究中，11 例難治性宮腔粘連和5 例子宮內(nèi)膜萎縮患者通過移植自身的外周血骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，3 例自然受孕，7 例經(jīng)胚胎移植受孕。BMDSC 是臨床移植最常見的來源，然而，提取的過程，并發(fā)癥的風(fēng)險以及年齡相關(guān)的自我更新能力的下降限制了其使用，并阻礙了臨床試驗。

3 3D 生物打印的ERC 生物支架治療宮腔粘連的可行性和局限性

組織工程學(xué)是治療宮腔粘連最有前途的方法之一，具有重建功能失調(diào)組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的潛力。但往往無法模仿天然組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，個性化和精確度仍是挑戰(zhàn)[24]。3D 打印革命性地解決了這些問題，可創(chuàng)建出具有異質(zhì)成分和復(fù)雜體系結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)造[25]。研究表明，3D 打印后發(fā)育的干細(xì)胞球體具有更強的分化能力[26-27]，同時可以顯著提高細(xì)胞在體內(nèi)的存活率。

Ji 等[28]將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell，hiMSC）細(xì)胞懸液（1×106個/mL）、20%明膠和4%海藻酸鈉在37 ℃下以2∶1∶1 混合制成3D 生物打印墨水。將混合物裝入擠出式多噴嘴3D 生物打印機中，打印時細(xì)胞-水凝膠混合物保持在25 ℃。在考慮仿生結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上，選擇了內(nèi)徑為100 μm 的打印噴嘴。設(shè)置了相應(yīng)的打印機參數(shù)（擠出速度和噴嘴掃描速度分別為0.1 mL/s和2.5 mm/s），打印出高3 mm、直徑5 mm 的圓柱體支架。將3D 支架在5 ℃的10%氯化鈣（W/V）溶液中交聯(lián)5 min，洗去殘留的氯化鈣溶液后，轉(zhuǎn)移到DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡證實，3D 打印過程不影響hiMSC 的存活率，為（86±4）%。將負(fù)載細(xì)胞的3D 生物支架移植到宮腔粘連的大鼠體內(nèi)。形態(tài)上，3D 生物打印的hiMSC 支架能顯著促進(jìn)子宮深層刮除后的子宮內(nèi)膜再生和修復(fù)。功能上，能促進(jìn)子宮內(nèi)膜容受性的恢復(fù)。在妊娠結(jié)局中，3D生物打印的hiMSC 組妊娠率為60%，hiMSC 組為33%，2 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3D 打印水凝膠可以支持hiMSC 在體內(nèi)和體外的長期生存能力。動物模型證實了3D 打印的hiMSC 負(fù)載水凝膠支架有助于損傷子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。

Zheng 等[29]收集健康生殖女性的月經(jīng)血，將ERC從月經(jīng)血中分離并進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)的ERC 移植到小鼠的腋窩皮下區(qū)域，給予雌二醇注射4～6 周，孕酮注射2 周后，移植區(qū)可見子宮內(nèi)膜組織，重建的子宮內(nèi)膜組織通過周圍脂肪組織的毛細(xì)血管提供營養(yǎng)和氧氣。因此推測，ERC 在小鼠體內(nèi)可重建子宮內(nèi)膜組織。與2D 平面培養(yǎng)的細(xì)胞不同，3D 培養(yǎng)的細(xì)胞由單個細(xì)胞在3D 組織結(jié)構(gòu)中形成細(xì)胞球體。這些細(xì)胞球體更像是生理組織發(fā)育和愈合過程中出現(xiàn)的細(xì)胞凝聚。此外，先前的一些研究表明，打印后發(fā)育的干細(xì)胞球體具有更強的分化能力[26]。相比直接移植，3D打印的水凝膠在降解前可以保持其原始的3D 超微結(jié)構(gòu)，從而為細(xì)胞在體內(nèi)創(chuàng)造了良好的生存環(huán)境[30]。另一方面，被招募到水凝膠中的細(xì)胞可以分泌基質(zhì)蛋白，在失去3D 打印支架的物理支持后，局部建立自己的ECM，并實現(xiàn)進(jìn)一步細(xì)化的組織重塑。鑒于子宮內(nèi)膜損傷后缺乏ECM 結(jié)構(gòu)，恢復(fù)原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和功能是困難的。在這種情況下，3D 細(xì)胞打印可以提供一個更精確和仿生的生理環(huán)境，可能治療效果更好。因此，有理由相信打印后的ERC 生物支架可以局部分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，恢復(fù)子宮容受性。

然而，Ji 等[28]研究發(fā)現(xiàn)再生的子宮內(nèi)膜組織在結(jié)構(gòu)和功能上仍與正常子宮內(nèi)膜組織有差異。本文筆者認(rèn)為這些差異可以通過幾種方法來優(yōu)化。例如，3D 打印水凝膠仍需要表面修飾，通過誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化或在生物反應(yīng)器中提高細(xì)胞的存活率等。該研究的另一局限是嚙齒類動物與人類之間的顯著差異，包括生育生理和子宮解剖。因此，選擇大型動物模型對于獲得更多與人類潛在應(yīng)用相關(guān)的結(jié)果是很有必要的。關(guān)于使用3D 生物打印治療宮腔粘連方面的文獻(xiàn)研究很少，需要在該領(lǐng)域進(jìn)一步探索，完善相關(guān)實驗，以此來充分對3D 生物打印的ERC 生物支架治療宮腔粘連的認(rèn)識，指導(dǎo)宮腔粘連治療并改善預(yù)后。

4 結(jié)語和展望

宮腔粘連常見的治療方法均存在一定的局限性，復(fù)發(fā)率高且妊娠率低；因此，目前還沒有針對子宮內(nèi)膜再生和防止宮腔粘連復(fù)發(fā)該問題最佳的治療策略。在各種動物模型和臨床研究中，3D 打印的生物支架在治療女性宮腔粘連方面顯示出了巨大潛力，提高了學(xué)者們對其治療宮腔粘連疾病的機制和潛力的認(rèn)識。但是，3D 生物打印的ERC 生物支架治療宮腔粘連的應(yīng)用處于臨床前研究或早期臨床試驗階段，仍然面臨著許多問題，其安全性和有效性需要進(jìn)一步研究。開發(fā)打印技術(shù)和多學(xué)科互補可能是解決這些問題的有效途徑。在不久的將來，隨著技術(shù)在各個方面的成熟，3D 打印患者衍生的ERC 負(fù)載的水凝膠支架可能是治療宮腔粘連的有效方法。