青稞根腐病生防放線菌的篩選及防效研究

李雪萍，徐冬麗，劉梅金，許世洋，王國(guó)平，郭建煒，李建軍，李敏權(quán)

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅甘南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅合作 747000； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

青稞(L. var. nudum Hook.f.)是我國(guó)藏區(qū)人民的主食，對(duì)藏區(qū)的發(fā)展和穩(wěn)定作用重大。在西北青藏高原地區(qū)，青稞根腐病的發(fā)病率達(dá)5%～20%，嚴(yán)重影響青稞的生產(chǎn)。目前，有關(guān)青稞根腐病的研究較少。關(guān)于青稞根腐病的防治，在國(guó)外，主要通過(guò)選育抗禾谷鐮孢的大麥品系及采用化學(xué)藥劑與木霉素結(jié)合的方法進(jìn)行；在國(guó)內(nèi)，辛忠民等開(kāi)展了篩選化學(xué)藥劑進(jìn)行防治的研究?？剐云贩N選育難度大，化學(xué)防治易引起病原菌產(chǎn)生抗藥性，且容易造成環(huán)境污染等負(fù)面效應(yīng)。因此，生物防治成為了研究熱點(diǎn)。

目前，針對(duì)由鐮孢菌引起的根腐病已發(fā)現(xiàn)了多種有良好防效的生防真菌，如哈茨木霉和康寧木霉對(duì)由尖鐮孢、半裸鐮孢、燕麥鐮孢和腐皮鐮孢引起的苜蓿根腐病有良好的防效；灰黃青霉和土曲霉對(duì)由鐮孢菌引起的草莓根腐病防效較好；淡紫青霉對(duì)尖鐮孢菌抑制作用較強(qiáng)；可減輕由鐮孢菌屬引起的土傳病害。在生防細(xì)菌方面，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)大豆根腐病、馬鈴薯枯萎病以及由立枯絲核菌、腐皮鐮孢、尖鐮孢和鏈格孢引起的番茄根腐病防效良好；枯草芽孢桿菌對(duì)由鐮孢菌引起的黃芪根腐病防效較好。在生防放線菌方面，以鏈霉菌屬為主的生防菌株對(duì)鐮孢菌的抑制效果較強(qiáng)，如渾圓鏈霉菌、黃鏈霉菌、微白黃鏈霉菌等。然而，在青稞根腐病生物防治方面，僅有岳海梅等發(fā)現(xiàn)球毛殼菌對(duì)青稞全蝕病和根腐病有良好的防效，在生防細(xì)菌方面仍為空白。鑒于此，本研究采集健康青稞植株及其根際土壤，以期從中篩選出對(duì)青稞根腐病有良好防效的放線菌，為青稞根腐病的生物防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采用多點(diǎn)采樣法在甘肅省甘南藏族自治州合作市、卓尼縣、臨潭縣等地采集青稞健康植株及其根際土壤各35份，裝入放有冰袋的保溫盒中，待用。

1.2 根部放線菌的分離

將健康青稞植株根部土壤沖洗干凈、晾干；在超凈工作臺(tái)中，剪下青稞根部放入裝有70%酒精的小燒杯中2～3 s；放入0.1%的升汞溶液中消毒10 s；用無(wú)菌水沖洗4次，放在已滅菌的濾紙上吸干水分；用無(wú)菌解剖刀將根段兩端切去，剩余根段接于高氏一號(hào)平板之上，每皿上均勻接三段根；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱約15～30 d后，在根段附近挑單菌落轉(zhuǎn)移到另一高氏一號(hào)平板之上，所得菌株即為放線菌。

1.3 土壤中放線菌的分離

取10 g從健康青稞植株根部抖下的土壤，裝入盛有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在振蕩機(jī)上振蕩10 min；將振蕩后的土壤懸液稀釋到10，用無(wú)菌移液槍吸取50 μL于高氏一號(hào)平板之上，立即用涂布器涂抹均勻；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，挑單菌落轉(zhuǎn)移至另一高氏一號(hào)平板，所得菌落即為放線菌。

1.4 菌株純化

將分離得到的放線菌菌株采用平板劃線法純化，觀察其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，2～3次后純化，然后在PDA培養(yǎng)基繁殖備用。

1.5 拮抗放線菌菌株初篩

采用平板對(duì)峙法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行，即用直徑為2.5 mm的打孔器打取平板培養(yǎng)的供試病原木賊鐮孢菌，接種于直徑為9 cm的PDA平板正中心；將待測(cè)放線菌等距離點(diǎn)接4次于距病原菌邊緣2 cm處，每株放線菌5組重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，測(cè)量抑菌圈。

1.6 拮抗放線菌復(fù)篩

對(duì)初篩得到的平均抑菌圈大于20 mm的放線菌用發(fā)酵液法進(jìn)行復(fù)篩，即將菌株接種于裝有200 mL培養(yǎng)液(馬鈴薯∶葡萄糖=10∶1)的500 mL的三角瓶中，每株菌3個(gè)重復(fù)，在28 ℃、150 r·min的搖床中振蕩培養(yǎng)5 d；將培養(yǎng)液裝入離心管中，10 000 r·min離心10 min；將上清液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，取1 mL濾液于預(yù)先制備好的PDA平板上，用涂布器涂抹均勻，3個(gè)重復(fù)，制成帶毒平板；用無(wú)菌打孔器取供試病原菌接種于帶毒平板中央，以未帶毒的平板接種供試病原菌作為對(duì)照；25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測(cè)量供試病原菌的菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照平板病原菌菌落直徑-帶毒平板病原菌菌落直徑)/(對(duì)照平板菌落直徑-接入菌餅直徑)×100%

1.7 拮抗放線菌生防效果測(cè)定

采用盆栽法進(jìn)行防效測(cè)定，對(duì)生長(zhǎng)10 d的青稞植株進(jìn)行接菌處理，分別為接入40 mL無(wú)菌水(陰性對(duì)照，CK1)，接入病原菌懸液20 mL+無(wú)菌水20 mL(陽(yáng)性對(duì)照，CK2)，接病原菌懸液20 mL+篩選出的拮抗放線菌菌懸液20 mL(EG)，統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)和防效，防效=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.8 生防放線菌的鑒定

DNA提取采用OMEGA細(xì)菌試劑盒按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。反應(yīng)體系為25 μL，包括 DNA模板1.0 μL，10×Buffer(含2.5 mM Mg) 2.5 μL，Taq 聚合酶(5 U·μL) 0.5 μL，dNTP(10 mM)1.0 μL，Primer(±10 μM) 1 μL，ddHO補(bǔ)至25 μL；輕彈混勻，瞬時(shí)離心收集管壁上的液滴至管底。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃下延伸 7 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后，取2 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將純化后的PCR 產(chǎn)物送于北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用的測(cè)序儀為ABI3730-XL。參照李雪萍等方法比對(duì)測(cè)定序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

基因序列采用CLUSTALX1.83、MEGA7處理；數(shù)據(jù)用Excel 2007和 DPS 15.10處理，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的篩選

從供試青稞的根及其根際土壤中共分離得到放線菌47株，經(jīng)過(guò)初篩得到16株抑菌圈大于20 mm的菌株(圖1)。

圖1 部分放線菌與病原菌拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of part actinomycetes and pathogen

初篩得到的NH4-1等16株菌抑菌效果如圖2所示。復(fù)篩時(shí)的生長(zhǎng)抑制率如表1所示，其中，AP11和H35-1兩株菌的抑制率最高，分別為80%和71.26%，二者間差異顯著，且顯著高于其他菌株，其他各菌株的生長(zhǎng)抑制率均低于60%。

圖2 放線菌抑制效果Fig.2 Inhibition effect of actinomycetes

表1 各放線菌對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率Table 1 Growth inhibition rate of each actinomycetes to pathogen

2.2 拮抗放線菌的防效

對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率較高的兩株菌H35-1和AP11進(jìn)行防效測(cè)定，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)， H35-1與AP11均對(duì)青稞根腐病防效良好，各處理間發(fā)病率、病情指數(shù)及防效均差異顯著，其中H35-1的防效為30.74%，AP11的防效為48.31%，使根腐病的病情指數(shù)降低50%左右。

表2 兩株放線菌的防效Table 2 Control effect of the two actinomycetes

2.3 拮抗放線菌的鑒定

對(duì)菌株AP11進(jìn)行分子鑒定，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示，與酸瘡痂鏈霉菌()的遺傳距離為零，自展支持率為100，鑒定其為酸瘡痂鏈霉菌。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

3 討 論

3.1 拮抗放線菌的篩選

定殖在植株體內(nèi)及根際土壤中的放線菌是寶貴的生物防治資源，其能夠抑制靶標(biāo)病原物的生長(zhǎng)從而起到防治植物病害的作用。本研究中采用平板對(duì)峙法從青稞植株及根際土壤中初篩得到47株對(duì)青稞鐮孢根腐病病原具有拮抗作用的放線菌，不同菌株抑制病原菌生長(zhǎng)的作用效果不一。

目前國(guó)內(nèi)仍缺乏對(duì)菌株拮抗效果的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，僅有楊 蕾等、張 瑾等對(duì)拮抗菌株的拮抗效果進(jìn)行了初步的分級(jí)，故本研究根據(jù)初篩結(jié)果共挑選16株抑菌圈大于20 mm的菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各放線菌對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率與初篩拮抗效果一致，這與曾文婷等、李 威等的研究結(jié)果相似。但是部分初篩效果較好的菌株經(jīng)復(fù)篩后其抑菌效果一般，這可能與其產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)種類、代謝物質(zhì)種類和量的不同有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究。

3.2 拮抗放線菌的防效

本研究對(duì)拮抗性能較好的菌株H35-1和AP11進(jìn)行防效測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株放線菌對(duì)青稞鐮孢根腐病的防效良好，與復(fù)篩結(jié)果一致，說(shuō)明其產(chǎn)生的活性物質(zhì)穩(wěn)定性良好。但在田間應(yīng)用中，土壤環(huán)境因子復(fù)雜，菌株還會(huì)受微生物間相互作用及植物與根際微生物間關(guān)系的影響，如賴寶春等研究發(fā)現(xiàn)，盆栽防效良好的單一菌劑在田間試驗(yàn)中效果并不明顯。因此，其防效需要進(jìn)一步田間實(shí)施驗(yàn)證。

生防菌的防病性不僅與其本身相關(guān)，還可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵條件優(yōu)化等途徑進(jìn)行提高，如梁春浩等通過(guò)對(duì)放線菌門暗黑鏈霉菌的培養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)番茄葉霉病的抑菌活性顯著提高。大量研究表明，復(fù)合菌劑處理可顯著降低發(fā)病率，對(duì)植物病害有較高的防效。因此，本研究對(duì)所篩選具有良好防效菌株的發(fā)酵條件及復(fù)合配比等有待進(jìn)一步研究。鏈霉菌屬的多數(shù)菌株是良好的生防菌資源，具有生防廣譜性，本研究對(duì)所篩選的高效防病菌株AP11鑒定發(fā)現(xiàn)，其為酸瘡痂鏈霉菌，屬鏈霉菌屬且防效較好，且無(wú)致病性，與姚錦愛(ài)等、熊仕俊等研究結(jié)果一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，酸瘡痂鏈霉菌是馬鈴薯和白蘿卜瘡痂病的病原，這可能和寄主以及生長(zhǎng)環(huán)境等因素相關(guān)。