黃芪多糖粉對綿羊口蹄疫疫苗免疫效果的影響

王進(jìn)挺

（寧夏大學(xué) 750000）

FMD是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度傳染性疫病，F(xiàn)MD傳播速度快，傳染范圍較廣，會給養(yǎng)殖場帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前主要通過接種疫苗提高免疫水平以防控FMD。有時接種疫苗后，不能達(dá)到有效的免疫效果。植物多糖可調(diào)節(jié)免疫功能，且資源豐富，是免疫藥理學(xué)研究熱點(diǎn)。植物多糖包含當(dāng)歸多糖、牛膝多糖、黃芪多糖等百余種。本研究主要分析黃芪多糖對綿羊口蹄疫疫苗免疫效果。

1 黃芪多糖的理化性質(zhì)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，其富含多種治病成分，含量最高的是黃芪多糖（APS），具有非常強(qiáng)大的免疫活性[1]。APS通常為棕黃色精細(xì)粉末，由葡聚糖、雜多糖、中性多糖和酸性多糖組成，屬于水溶性的中性多糖。黃芪不同部位的多糖含量不同，莖和葉的多糖含量遠(yuǎn)低于根中的；黃芪在不同生長地區(qū)（黑龍江、內(nèi)蒙古、山西、甘肅）APS的含量也不同，其中甘肅地區(qū)的APS含量最高。在不同生長環(huán)境下黃芪中APS不同（人工栽培>野生>半野生）。Zhang文獻(xiàn)指出[2]，1～3年生的黃芪中APS含量，1年生的APS含量最高，且多糖會隨生長時間逐漸降低。

2 APS的提取方法

因制備方法不同，相同劑量的黃芪提取出的APS純度也不同。APS提取方法包含黃芪粗多糖提取和APS提純兩個部分。黃芪粗多糖提取方法主要有水提醇沉法、堿提醇沉法和微波提取法等。水提醇沉法提取APS的最佳方式是在提取溫度為60℃，將料水的比例設(shè)置為1∶20（g/mL），提取4h，共提取兩次。用水提取過程中，會提取到其他物質(zhì)，如皂苷和類黃酮等物質(zhì)，這些物質(zhì)后期較難分離，致使APS純度較低。此方法能耗較高，經(jīng)濟(jì)效益較低。堿提取法對APS的提取率較水提取法高，堿會破壞黃芪纖維，促進(jìn)多糖流動，提高提取率，堿提醇沉法的APS提取率是水提醇沉法的3.53倍。微波提取減少萃取劑的用量，縮短萃取時間，提高APS的產(chǎn)量。微波提取可使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中的酶失活，有利于APS流動，提高多糖的產(chǎn)量。微波提取法可有效縮短時間，可廣泛應(yīng)用。

不同的提取方法影響APS的組成，而APS的不同結(jié)構(gòu)也影響其功能。通過水煮和醇沉，分別用30%和70%乙醇分級沉淀得到APS的兩組成分APS-Ⅰ（糖含量94.59%）和APS-Ⅱ（糖含量97.57%）。將APS-Ⅰ、APS-Ⅱ用于小鼠腹水腫瘤中，發(fā)現(xiàn)APS-Ⅰ（50mg/kg）對腫瘤的抑制率為55.47%，對腫瘤的抑制效果明顯高于APS-Ⅱ（50mg/kg）對腫瘤的抑制率為47.72%。APS-Ⅰ對腫瘤的抑制效果明顯高于APS-Ⅱ。還有使用超聲輔助來提取APS，APS提取率可高達(dá)92.1%。當(dāng)pH=9時，提取的APS的產(chǎn)率和純度最高。此外，還有其他方法的提取方法，如加壓液體萃取、超高壓技術(shù)、高壓脈沖電廠快速提取、微波輔助酸水解和綜合色譜等。通過均質(zhì)輔助負(fù)壓空化提取APS可以將多糖的產(chǎn)率提高到15%。

3 黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

3.1 APS對免疫器官的影響

免疫器官包含中樞免疫器官（骨髓、胸腺和禽類法氏囊）和外周免疫器官（淋巴結(jié)和脾臟等），免疫器官的發(fā)育程度直接決定機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱[3]。彭婷等[4]在肉雞日糧中添加不同劑量的APS，分別在2周、4周、6周時分析APS對肉雞生長及免疫的影響。結(jié)果顯示，APS添加100mL/kg，持續(xù)2周，可有效提高肉雞生長性能；APS添加50mL/kg，持續(xù)4～6周，可有效提高肉雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。表明APS通過加速免疫器官的生長來提高免疫力。

3.2 APS對免疫細(xì)胞的影響

免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞等，其作用是進(jìn)行特異性或非特異性免疫應(yīng)答。APS可增加B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞（DC）是激活免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。APS促進(jìn)DC的生長和成熟及其抗原呈遞能力，降低DC的內(nèi)吞作用活性。與此同時，APS還能誘導(dǎo)DC分化激活T細(xì)胞。宗慶華等[5]將200、100、50mg/kg的益生菌FGM發(fā)酵APS于1周前腹腔注射給腦損傷小鼠，結(jié)果顯示，與腦損傷小鼠模型對比，高濃度APS組的脾臟及胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯升高(P＜0.05)；TNF-α和IL-1β水平明顯降低(P＜0.05)。說明益生菌FGM發(fā)酵APS可提高腦損傷小鼠免疫力，且具有免疫保護(hù)作用。

3.3 APS對免疫分子的影響

免疫分子是由T、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等通過抗原刺激后產(chǎn)生，包含免疫球蛋白（Ig）、補(bǔ)體系統(tǒng)和細(xì)胞因子等。APS在不同條件下對細(xì)胞因子發(fā)揮不同作用。正常生理?xiàng)l件下，可促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生并增強(qiáng)免疫力；機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，APS可減少炎癥因子并保護(hù)細(xì)胞。APS可促進(jìn)脾細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素2（IL-2），誘導(dǎo)干擾素（IFN），并促進(jìn)IL-3、IL-4、IL-6的分泌。APS還能改善磷酰胺肉雞空腸中IL2、IL10的表達(dá)[6]。APS在Ig中是通過IgA、IgG、IgM介導(dǎo)免疫。APS增加IL2、IL3、IL4、IFN、IgM和IgG的表達(dá)，降低IgE的表達(dá)。Shu Y 等[7]指出，APS可提升小獵犬血清中IgA、IgG、IgM和IFN-γ水平，促進(jìn)犬小腸IgAmRNA和SIgA蛋白表達(dá)，提高機(jī)體免疫力。

3.4 APS能提升動物抗病毒能力

應(yīng)用APS可幫助家禽提高抵抗多種病毒的能力，如APS可通過減少氧化應(yīng)激和激活NF-KB信號通路來抑制豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制，APS能減少H9N2禽流感病毒（AIV）的復(fù)制并促進(jìn)動物早期體液免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫力。針對動物常感染的病毒列出APS最佳使用量，以提高動物抗病毒能力：第一，在動物飲用水中添加 0.4g/L APS，調(diào)節(jié)血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平保持動態(tài)平衡，維持機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫平衡，進(jìn)而抑制呼腸孤病毒（MDRV）感染。第二，APS>10mg/mL時，可有效抑制腸桿菌、沙門菌和綠膿桿菌，且APS的濃度越高抑制效果越強(qiáng)。30mg/mL APS可有效抑制綠膿桿菌，40mg/mL APS可有效抑制大腸桿菌和沙門菌。第三，APS可防治黃曲霉毒素B1（AFB1）感染引起的動物肝損傷，可通過在動物飲用水腫加入500或1000mg/mL APS，保持喂養(yǎng)7d，可有效降低肝臟指數(shù)，降低血清 ALT、AST 和ALP 水平。

4 黃芪多糖對綿羊口蹄疫疫苗免疫效果

綿陽口蹄疫病是全球主要防控的傳染病之一，治療效果不良，主要進(jìn)行免疫預(yù)防。口蹄疫以O(shè)型和亞洲Ⅰ型為主，因此臨床中常使用牛羊口蹄疫O型、亞洲Ⅰ型二價滅活疫苗，可以減少免疫次數(shù)，且能對兩種主要流行的血清型起到免疫作用。目前針對羊口蹄疫需進(jìn)行三次免疫，三免后間隔6個月還需進(jìn)行加強(qiáng)免疫。注射疫苗后，動物體內(nèi)抗體效價會隨時間降低，而應(yīng)用一定劑量的APS可延長高水平抗體效價的時間，增強(qiáng)口蹄疫免疫效果。Shan等[8]文獻(xiàn)指出，口服APS可促進(jìn)新城疫疫苗接種雞免疫功能和IgA細(xì)胞的形成，并增加分泌型IgA的分泌，進(jìn)而改善控場粘膜免疫。淋巴細(xì)胞的增殖能力反映機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)水平。腸道含有大量淋巴細(xì)胞，一類是腸道黏膜固有層分布著機(jī)體約80%IgA＋細(xì)胞。該類細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到腸腔表面形成分泌型IgA（SIgA），保護(hù)腸黏膜完整，是評估黏膜免疫水平的一項(xiàng)指標(biāo)。另一類是淋巴細(xì)胞是IELs，具有細(xì)胞毒活性，可對IL-2、IL-4、IL-7等因子進(jìn)行表達(dá)，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。李任軍等[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服APS組的IgA＋細(xì)胞和IELs的數(shù)量明顯高于未口服APS組，說明口服黃芪多糖能增強(qiáng)腸道黏膜免疫。黃芪多糖口服后直接作用于胃腸道黏膜，增強(qiáng)消化道的黏膜免疫反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。

5 小結(jié)

目前養(yǎng)殖業(yè)頻繁過量的應(yīng)用抗生素，導(dǎo)致動物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性與過多的藥物殘留，尋求天然綠色的添加劑是必然途徑。APS可作為天然添加劑取替抗生素。

APS既能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高抗炎免疫作用，還能提高機(jī)體抗病毒能力。因此，可將APS作為疫苗佐劑添加到動物的日料中，增加疫苗抗體效價和免疫因子含量來提高疫苗的免疫效果，值得推廣應(yīng)用。