來(lái)鳳藤茶中二氫楊梅素的純化工藝研究

樊慶濤，羅微，劉梁，趙玲，劉華英，子文杰，陳新*

（1.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北來(lái)鳳騰升香料化工公司，湖北 恩施 445700；3.深圳市櫻落科技有限公司，廣東 深圳 518000）

藤茶，為葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬（Ampelopsis Michx.）顯齒蛇葡萄 [Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩葉，經(jīng)傳統(tǒng)加工揉制、干燥而成[1]。在享有中國(guó)土家第一縣美譽(yù)的湖北省來(lái)鳳縣，藤茶更是擁有上百年的應(yīng)用歷史。當(dāng)?shù)卮迕癯龑⑵渥鳛椴枞粘ｏ嬘猛猓彩褂盟鼇?lái)治療內(nèi)部炎癥、腹瀉等常見疾病[2]。藤茶作為一種新資源食品，其主要活性成分為二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），除具有黃酮類化合物的一般活性外，還具有解除醇中毒、預(yù)防酒精肝、脂肪肝、抑制肝細(xì)胞惡化、降低肝癌發(fā)病率等作用[3]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)藤茶的研究較多，但現(xiàn)有針對(duì)藤茶中二氫楊梅素的純化工藝相對(duì)繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高[4]。本文以來(lái)鳳藤茶為原料，嘗試開發(fā)一種高效、低成本的藤茶二氫楊梅素生產(chǎn)工藝，為促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶：湖北來(lái)鳳騰升香料化工公司；無(wú)水乙醇（分析純）:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；磷酸（色譜純）：天津賽孚瑞科技有限公司；甲醇（色譜純）：美國(guó)TEDIA天地試劑公司；大孔吸附樹脂（D101、HPD-100、S-8、AB-8）：東鴻化工有限公司。其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。大孔吸附樹脂具體參數(shù)見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）：美國(guó)安捷倫公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS10型）：美國(guó)賽默飛世爾公司；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）：上海興亞凈化材料廠；摩爾超純水器（細(xì)胞型-1810A）：重慶摩爾水處理有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（V-855）：瑞士Buchi公司；電子天平（XS204）：美國(guó)梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 DMY高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精準(zhǔn)稱取DMY標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別用移液槍吸取 1、2、4、6、8、10 mL 標(biāo)準(zhǔn)品母液，用無(wú)水乙醇定容至10 mL容量瓶中，配成6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液[5-6]。

色譜柱：Agilent C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫（0 min～25 min，甲醇-0.03%磷酸體積比 12 ∶88；25 min～35 min，甲醇-0.03%磷酸體積比 65 ∶35；35 min～40 min，甲醇-0.03%磷酸體積比12∶88）；檢測(cè)波長(zhǎng)290nm；流速0.7mL/min；柱溫 35℃[7]。

分別將6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，裝入進(jìn)樣瓶，分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 來(lái)鳳藤茶總黃酮的提取及預(yù)處理

取來(lái)鳳藤茶 2 000 g，在料液比 1∶15（g/mL）、乙醇濃度80%、提取溫度80℃、時(shí)間3 h的條件下，水浴加熱提取2次，合并提取液[8]，取1 mL用HPLC測(cè)量濃度。將提取液旋蒸濃縮至無(wú)醇味后得浸膏，加入5倍體積的蒸餾水混懸，然后分別用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，分別取樣測(cè)定各萃取部位中DMY的濃度[9-10]。

1.3.3 靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選大孔吸附樹脂

選擇 D101、HPD100、S-8、AB-8 4 種不同極性的大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，預(yù)處理后用濾紙吸干表面水分，分別稱取10 g裝入錐形瓶中。加入100 mL濃度為50 mg/mL的DMY溶液，分別在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h取樣，分別測(cè)量上清液中DMY濃度[11]。待上清液DMY濃度無(wú)變化時(shí)，確認(rèn)為樹脂吸附飽和。用濾紙吸干表面水分，平均分4等份，分別用30%、50%、70%、90%乙醇解吸，于 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 取樣，分別測(cè)量上清液中DMY濃度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算吸附量和解吸率[12]。

式中：Q 為吸附量，mg/g；D 為解吸率，%；M0為上樣液中DMY的質(zhì)量，g；M1為上清液中DMY的質(zhì)量，g；M2為解吸液中DMY的質(zhì)量，g；M3為解吸時(shí)上清液中DMY的質(zhì)量，g；S1為樹脂的質(zhì)量，g。

1.3.4 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)確定洗脫溶劑

選取靜態(tài)吸附試驗(yàn)選出的樹脂，預(yù)處理后濕法裝入10 cm×100 cm層析柱中，用水平衡。采用干法上樣方式將萃取浸膏于10%乙醇中與大孔吸附樹脂以質(zhì)量比1∶1混勻，平均分成4等份，用水洗至無(wú)色無(wú)醇味無(wú)黃酮泄露后，分別以30%、50%、70%、90%乙醇為起點(diǎn)進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在80 mL/min。以甲酸∶二氯甲烷 ∶乙酸乙酯（1∶4∶5，體積比）為展開劑，DMY標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，用薄層色譜法（thin—layer chromatography，TLC）監(jiān)測(cè)洗脫[13-14]，收集洗脫液，濃縮、真空干燥后得晶體粉末。

1.3.5 DMY樣品的純度測(cè)定

取制備所得的晶體粉末采用1.3.1中的HPLC條件進(jìn)行純度測(cè)定[15-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 來(lái)鳳藤茶提取液的預(yù)處理結(jié)果分析

按照1.3.1的方法繪制DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖1。

圖1 二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of DMY

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=34036x+20.292，R2=0.999 7，通過(guò)HPLC檢測(cè)，提取液中的DMY濃度為3.95 mg/mL。對(duì)4個(gè)萃取部位萃取液和剩余水溶液分別用HPLC分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑萃取液中DMY的含量Fig.2 The content of DMY in different solvent extracts

由圖2可知，萃取后的DMY分別分布在二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中，石油醚和剩余部分未檢出DMY，其中乙酸乙酯部位DMY含量最高，占總量的96%。

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附篩選結(jié)果

4種大孔樹脂預(yù)處理后，進(jìn)行DMY的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，計(jì)算得各樹脂對(duì)DMY的吸附量與解吸率，結(jié)果見圖3～圖7。

圖3 靜態(tài)吸附吸附量結(jié)果Fig.3 Results of static adsorption capacity

圖4 30%濃度乙醇溶液解吸率結(jié)果Fig.4 Results of resolution rate of 30% ethanol solution

圖5 50%濃度乙醇溶液解吸率結(jié)果Fig.5 Results of resolution rate of 50% ethanol solution

圖6 70%濃度乙醇溶液解吸率結(jié)果Fig.6 Results of resolution rate of 70% ethanol solution

圖7 90%濃度乙醇溶液解吸率結(jié)果Fig.7 Results of resolution rate of 90% ethanol solution

由圖3可知，樹脂S-8吸附效果最好，吸附量最高可達(dá)18.0 mg/g；HPD-100和AB-8次之，吸附量為14.1 mg/g；D101吸附效果較差，最高吸附量?jī)H為9.1 mg/g。由圖4～圖7可知，當(dāng)乙醇作為洗脫液解吸時(shí)，大部分DMY均可被洗脫下來(lái)。隨著乙醇濃度的增大，解吸率變化不大，除S-8的解吸率較低，在69%～73%之間，其余3種樹脂對(duì)DMY的解吸率均在80%～87%范圍內(nèi)。結(jié)合樹脂對(duì)DMY的吸附與解吸附效果，選擇HPD-100樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

2.3 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果

HPD-100大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果見表2，4組試驗(yàn)分別以不同濃度乙醇作為起點(diǎn)梯度洗脫，利用TLC監(jiān)測(cè)洗脫結(jié)果見圖8。

表2 不同濃度乙醇溶液洗脫對(duì)比Table 2 Comparison of different concentrations of ethanol solution elution

圖8 不同濃度乙醇洗脫薄層色譜圖Fig.8 TLC of different concentration ethanol elution

由圖8可以看出，在每組的洗脫試驗(yàn)中，DMY都集中在最開始使用的洗脫劑的洗脫液中。雖然高濃度乙醇可以以更少的柱體積洗脫出DMY，但低濃度的乙醇洗脫可以得到純度更高的樣品。試驗(yàn)表明，高濃度乙醇洗脫下的洗脫液雜質(zhì)較多，濃縮時(shí)易起泡，增加控制難度，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但低濃度乙醇與之相反，在濃縮過(guò)程中隨著乙醇濃度降低，樣品會(huì)主動(dòng)結(jié)晶析出，可得到純度大于95%的DMY樣品，有利于簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程中的后期處理。

2.4 DMY純度測(cè)定

將提取的DMY樣品與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜比對(duì)如圖9～圖10，在相同保留時(shí)間下，通過(guò)計(jì)算峰面積比值得樣品純度為95.4%。

圖9 DMY標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜Fig.9 Liquid chromatogram of DMY standard

圖10 樣品液相色譜Fig.10 Sample liquid chromatogram

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)萃取溶劑的考察，提取液中96%的DMY可以經(jīng)過(guò)萃取，轉(zhuǎn)移至乙酸乙酯部位。在靜態(tài)吸附考察中，對(duì)比4種大孔吸附樹脂，HPD-100樹脂對(duì)DMY的吸附和解吸效果均高于其他樹脂。其對(duì)DMY的吸附量最高可達(dá)到14.1 mg/g，解吸率可達(dá)到87%以上。在動(dòng)態(tài)吸附考察中，30%乙醇溶液做洗脫劑，3.5 BV可洗脫下95%以上的DMY，濃縮干燥后，純度達(dá)到95.4%以上。此方法試驗(yàn)工藝條件簡(jiǎn)單，不需要同時(shí)串聯(lián)多個(gè)色譜柱，不需要采取多次水重結(jié)晶或其他方法即可獲得較高純度的DMY。同時(shí)，采用30%濃度乙醇洗脫使成本降低，安全性增高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。