Shh 信號參與神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元分化與再生的研究進(jìn)展*

劉欣媛,陶一鳴,杜艷軍,2△,曾 鵬,田 青,李蔚嫻

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 1針灸骨傷學(xué)院 2針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,武漢 430030

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)和亨廷頓病(Huntington’s Disease,HD)是較為常見的神經(jīng)退行性疾病,盡管它們的起源、發(fā)展及臨床表現(xiàn)各異,但神經(jīng)元數(shù)量過少是它們的共同病理特征,神經(jīng)元丟失過多與神經(jīng)元再生障礙是引起此病理特征的重要機(jī)制之一[1-3]。神經(jīng)退行性疾病的病變過程其實(shí)是內(nèi)源性神經(jīng)元分化再生失敗的過程[4],目前神經(jīng)退行性疾病尚無特效療法,Shh信號作為有絲分裂原,可以促進(jìn)新皮層生長,調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)直接或間接分化為神經(jīng)元[5]。Shh信號刺激內(nèi)源性神經(jīng)元再生,是探索神經(jīng)退行性疾病治療策略的新方向。但關(guān)鍵在于如何有效激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)元再生以重建功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。本文通過對Shh信號通路的組成及其在AD、PD、HD中參與神經(jīng)元分化與再生的作用機(jī)制進(jìn)行綜述,闡明有效激活Shh信號是促進(jìn)神經(jīng)元分化與再生的可能途徑,以期為治療神經(jīng)退行性疾病或延緩其疾病進(jìn)程提供新思路。

1 Shh信號通路的組成與特性

Hedgehog信號通路對人和動物生長發(fā)育過程中細(xì)胞增殖起著至關(guān)重要的作用,其基因家族包括音猬因子(sonic hedgehog,Shh)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog,Dhh)、印度刺猬因子(Indian hedgehog,Ihh)[6]。Shh信號是促進(jìn)新皮層生長機(jī)制的核心,調(diào)節(jié)NSCs直接或間接產(chǎn)生神經(jīng)元,影響少突膠質(zhì)細(xì)胞形成和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。如在少突膠質(zhì)細(xì)胞的生成中需要皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)元間的Shh配體,以維持新皮層少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量正常[7]。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中,Shh增加神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá),誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞并從中釋放神經(jīng)膠質(zhì)遞質(zhì)[8]。還有研究表明可通過抑制Shh信號來維持NSCs靜止和激活之間的平衡,以保持神經(jīng)元活性與突觸可塑性[9]。

Shh信號通路的核心部件由分泌型糖蛋白Shh配體、Smoothened(Smo)跨膜蛋白受體、Ptched(Ptch)跨膜蛋白受體、核轉(zhuǎn)錄因子Gli家族(Gli-1,2,3)、蛋白激酶A(PKA)、校正器(suppressor of fused,Sufu)等組成。有研究證實(shí)在出生后和成年小鼠的皮質(zhì)、海馬和小腦中存在Shh mRNA和Shh-N大量表達(dá),且伴隨出生后年齡增長逐漸增加,這與大腦發(fā)育相吻合,在此期間神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均迅速增加,在將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞移除后,Shh蛋白水平?jīng)]有變化,表明Shh由神經(jīng)元產(chǎn)生[10]。Smo是一種經(jīng)過7次跨膜形成的螺旋結(jié)構(gòu)受體,在Shh信號通路中發(fā)揮“橋梁作用”?？缒さ鞍资荏wPatched1(Ptch1)與Smo特異性結(jié)合,抑制Shh信號通路[11]。哺乳動物中與特定神經(jīng)元再生相關(guān)的Gli1以正反饋形式激活基因轉(zhuǎn)錄,是檢測Shh信號通路激活與否的重要指標(biāo)[12]。

遺傳學(xué)研究表明,Shh信號的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)中心是初級纖毛,纖毛內(nèi)的Shh信號對腹側(cè)神經(jīng)管的形成和神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)至關(guān)重要(轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如圖1)[13]。當(dāng)缺乏Shh信號時(shí),Ptch與Smo結(jié)合,Smo活性被抑制,Gli-F在多種激酶作用下磷酸化,并在接頭蛋白(β-Tr CP)介導(dǎo)的蛋白水解作用下產(chǎn)生Gli-R抑制靶基因入核;當(dāng)存在Shh信號時(shí),未與Ptch結(jié)合的Smo被磷酸化修飾后,在細(xì)胞表面受體樣蛋白Cdo等負(fù)向調(diào)節(jié)因子的作用下,聚集和活化于初級纖毛上,Gli-F水解轉(zhuǎn)化為Gli-A后亦促使靶基因入核[14]。此外,Shh信號通路還受相關(guān)因子正性或負(fù)性調(diào)節(jié),如生長抑制特異性蛋白1(growth arrest specific 1,Gas1)與Shh蛋白具有高度親和力呈正性調(diào)節(jié)[15],Sufu抑制Gli的轉(zhuǎn)錄呈負(fù)性調(diào)節(jié)[16],而糖原合成酶激酶-3(GSK-3)可雙向調(diào)節(jié)Shh信號通路[17]。影響Shh信號通路傳導(dǎo)的因素還包括衰老、性別等。如在不同時(shí)期Shh信號受激活的蛋白激酶C受體1(Rack1)的相反調(diào)控[18],雌性小鼠的海馬和皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)可因Ptch1的雜合突變出現(xiàn)小腦過度生長,而雄性卻無改變[19]。

圖1 初級纖毛中的Hh信號通路Fig.1 Hedgehog signaling pathway in the primary cilium

早期研究發(fā)現(xiàn),Shh在腹側(cè)端腦和下丘腦中表達(dá),并且對皮層下區(qū)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)正常分化為神經(jīng)元的過程發(fā)揮至關(guān)重要的作用[20]。與hiPSC相關(guān)的神經(jīng)模型證實(shí):Shh信號可介導(dǎo)hiPSC成為可再生物質(zhì)來源,用于分化為特定區(qū)域功能神經(jīng)元亞型,并且可以潛在地優(yōu)化神經(jīng)修復(fù)方案[21]。關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究表明,Shh信號通路在成年期可被重新激活,在大腦和脊髓中出現(xiàn)高表達(dá),能介導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育模式,誘導(dǎo)成年大鼠海馬齒狀回NSCs分化成為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞[22]。用腺病毒作為載體將表達(dá)Shh信號的DNA片段轉(zhuǎn)運(yùn)至海馬體中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬體細(xì)胞數(shù)目顯著增多,而環(huán)巴胺(Shh抑制劑)則抑制了海馬體神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖[23]。研究表明可將Shh作為一種分子標(biāo)記物,根據(jù)其在細(xì)胞中不同梯度的表達(dá)水平來區(qū)分中間神經(jīng)元、運(yùn)動神經(jīng)元等[24]。此外,Shh通路通過上調(diào)TJ蛋白(例如occludin和claudin-5)以促進(jìn)血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的完整性,對小鼠缺血性中風(fēng)后血腦屏障起到直接保護(hù)作用[25]。還可通過激活大鼠的Shh-Gli信號通路增強(qiáng)血管生成,對減輕腦缺血及再灌注損傷有較好療效[26]。神經(jīng)系統(tǒng)疾病較為復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,更加凸顯了研究靶向Shh信號通路用于治療神經(jīng)退行性疾病的潛在意義。

2 Shh信號對神經(jīng)退行性疾病的影響

2.1 Shh信號與AD

AD的病理特征中神經(jīng)元丟失過多可能早于β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)異常沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)出現(xiàn)[27],其中膽堿能神經(jīng)元大量損傷是AD神經(jīng)退行性改變的基礎(chǔ)之一[28]。以膽堿酯酶、N-甲基-D-天冬氨酸(Nmethyl-D-asparticacid,NMDA)、Aβ等為靶點(diǎn)開發(fā)的各類臨床藥物應(yīng)用,遠(yuǎn)期效果不佳且產(chǎn)生較強(qiáng)的外周副作用,根本原因可能在于未有效改善神經(jīng)元進(jìn)行性減少[29]。早期有研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)存在內(nèi)源性NSCs,但不能被主動激活使得其增殖、遷移和分化出現(xiàn)停滯,但將NSCs移植入AD模型大鼠腦內(nèi)后,發(fā)現(xiàn)AD大鼠海馬CA1區(qū)突觸素的吸光度值和神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,突觸和正性纖維的數(shù)量增多,表明外源性NSCs在AD大鼠腦中具有存活、增殖及重建神經(jīng)通路的能力,而腦內(nèi)Shh信號則參與了多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)分化為基底前腦膽堿能神經(jīng)元的過程[30-31]。Hu等[32]用Shh信號激動劑Purmorphamine誘導(dǎo)培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)第20天時(shí),90%hiPSCs源性的神經(jīng)前體細(xì)胞開始在內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起處表達(dá);第35天時(shí),約40%的細(xì)胞顯示出其前腦神經(jīng)元樣特征;第45天時(shí)可見成熟神經(jīng)元標(biāo)記物大量表達(dá),充分說明了Shh信號在NSCs向功能性膽堿能神經(jīng)元分化過程中發(fā)揮了良好效應(yīng)機(jī)制。

正常情況下,Shh信號誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的Ptc1和轉(zhuǎn)錄因子Gli1,而研究觀察發(fā)現(xiàn)Ptc1和Gli1在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的海馬中存在顯著缺陷,在低齡小鼠腦中明顯升高,此現(xiàn)象在AD患者大腦尸檢中得到了驗(yàn)證[33]。研究者為了驗(yàn)證Aβ肽是否影Ptc1-Gli1信號傳導(dǎo),用Aβ1-42處理膠質(zhì)前體細(xì)胞(glial precursor cells,GPCs),發(fā)現(xiàn)高劑量Aβ1-42顯著降低Ptc1-Gli1水平,誘導(dǎo)NSCs/GPCs進(jìn)入不對稱分裂期,最終導(dǎo)致這些前體細(xì)胞在Aβ毒性作用下死亡,神經(jīng)前體細(xì)胞儲備不足,最終引起AD大腦神經(jīng)元再生障礙,提示Ptc1-Gli1信號對維持成體大腦神經(jīng)環(huán)路完整性具有重要調(diào)控作用[34]。有研究者向AD轉(zhuǎn)基因動物模型APP/PS1小鼠注射內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑蛋白酶(protease nexin-1,PN-1),發(fā)現(xiàn)PN-1可參與調(diào)控Shh信號通路,減少海馬神經(jīng)元凋亡以恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)而影響AD發(fā)病進(jìn)程[35]。Shh蛋白水平在海馬NSCs/GPCs中升高的現(xiàn)象,進(jìn)一步提示激活Shh信號通路對成體NSCs/GPCs分化具有促進(jìn)作用,有助于AD海馬區(qū)整合新的功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以恢復(fù)功能障礙。

2.2 Shh信號與PD

中腦黑質(zhì)致密帶多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元缺失、紋狀體內(nèi)DA含量減少是PD的主要病理特征,逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元變性或促進(jìn)其生成一直是PD的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)[36]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn),哺乳動物體內(nèi)中腦DA能神經(jīng)元(mDA)能對運(yùn)動和學(xué)習(xí)獎勵相關(guān)的多種行為發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,這基于mDA軸突結(jié)構(gòu)異質(zhì)性,且m DA與在胚胎期所注射的Shh信號激活劑密切相關(guān)[37]。

研究發(fā)現(xiàn)在PD大鼠模型中,Shh信號在受損的中腦內(nèi)表達(dá)增加,參與恢復(fù)PD中腦DA神經(jīng)元發(fā)育[38]。Kriks等[39]將hiPSCs分化的中腦DA能神經(jīng)前體細(xì)胞,經(jīng)Shh信號與Wnt信號協(xié)同激活后植入PD小鼠模型中,PD小鼠經(jīng)安非他明誘導(dǎo)后的旋轉(zhuǎn)行為、前肢功能障礙以及中腦DA能神經(jīng)元存活率均得到改善,隨后在PD猴模型中也得到相同的結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)Shh還可以促進(jìn)PD模型中特定DA神經(jīng)元的體外和體內(nèi)存活,PD動物模型在神經(jīng)毒素誘導(dǎo)下出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的Shh信號,可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)過程[40]。當(dāng)然,也有研究提示Shh信號不是誘導(dǎo)DA能神經(jīng)前體細(xì)胞分化的唯一因素。如Suzuki等[41]使用在DA祖細(xì)胞中表達(dá)的表面標(biāo)記物來提高PSCs分化為多巴胺能(DA)神經(jīng)元的效率,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP2)也可在體外促進(jìn)NSCs向DA神經(jīng)元的分化。

2.3 Shh信號與HD

HD是一種常染色體顯性遺傳病,因IT15基因的1號外顯子中含有多態(tài)性三核苷酸(CAG)的重復(fù)序列,CAG重復(fù)轉(zhuǎn)錄超過36次時(shí),使其編碼的Htt蛋白功能發(fā)生變異,變異后的Htt蛋白的N端碎片在腦內(nèi)神經(jīng)元間隙中聚集,Htt蛋白與激動蛋白發(fā)生相互作用導(dǎo)致其異常擴(kuò)增,從而阻斷了軸突運(yùn)輸,最終影響神經(jīng)元功能[42]。目前研究已證實(shí)HD患者紋狀體-前腦皮質(zhì)下區(qū)存在神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失以及神經(jīng)退行性病變[43]。

黑質(zhì)DA能神經(jīng)元和紋狀體中間神經(jīng)元中產(chǎn)生的Shh可參與出生后神經(jīng)營養(yǎng)環(huán)路的形成[44]。Shh信號的短期效應(yīng)是導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)高效分化為DA能神經(jīng)元的關(guān)鍵,驗(yàn)證了Shh信號促進(jìn)誘導(dǎo)PSCs分化為特定的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能紋狀體中等棘狀神經(jīng)元(MSNs)。經(jīng)過進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),被移植到HD小鼠紋狀體中的hPSC源性神經(jīng)元可以存活并分化為多巴胺和c AMP調(diào)節(jié)的磷蛋白(dopamine and CAMP-regulated phospoprotei,DDRPP-32)陽性神經(jīng)元,同時(shí)HD小鼠在阿樸嗎啡(apomorphine,APO)誘導(dǎo)后的旋轉(zhuǎn)行為功能障礙也得到了改善[45]。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了Shh信號可參與hPSC源性MSNs的體內(nèi)移植,發(fā)揮改善HD病理模型中行為學(xué)表現(xiàn)異常的作用[46]?？梢哉J(rèn)為Shh信號促進(jìn)干細(xì)胞體內(nèi)分化是研究HD病理機(jī)制的較為理想的方案,更是逆轉(zhuǎn)HD神經(jīng)退行性病變的重要切入點(diǎn)之一。

3 展望

目前關(guān)于體外神經(jīng)元定向分化的研究結(jié)果表明,干細(xì)胞移植對包括AD、PD、HD在內(nèi)的病理模型都有明顯的治療效果[47-49]。既然通過激活腦內(nèi)Shh信號能輔助促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)元產(chǎn)生,那么將外源性NSCs植入大腦的特定微環(huán)境中,再由Shh信號誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖分化為具有特定功能的神經(jīng)元,即可借此突破神經(jīng)退行性疾病的治療難點(diǎn)。但是與Shh信號相關(guān)的干細(xì)胞移植在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍具有較大挑戰(zhàn)性,其中體外研究居多,而體內(nèi)研究較少。具體原因如下:①NSCs移植至腦內(nèi)后其存活率只有5～10%,同時(shí)NSCs分化為神經(jīng)元效率較低[50];②新生神經(jīng)元在已受損腦中存活、遷移、分化和整合為功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)尚有難度;③新生神經(jīng)元在活體內(nèi)的檢測受到一定制約。