霍亂弧菌新發(fā)菌株中vipA，vipB和clpV對(duì)T6SS轉(zhuǎn)錄調(diào)控

吳文軒，郭 揚(yáng)，張幸鼎，趙文婧

（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518107）

霍亂是一種烈性傳染病，2010 年海地爆發(fā)霍亂疫情，相對(duì)于El Tor 經(jīng)典株海地變種El Tor 霍亂弧菌不僅在臨床上表現(xiàn)出更快的傳播力和更高的死亡率，也在動(dòng)物模型上表現(xiàn)出更強(qiáng)的定植力和毒力［1-2］。已有研究表明，六型分泌系統(tǒng)（Type Ⅵsecretion system，T6SS）對(duì)霍亂弧菌的生存和致病起著關(guān)鍵作用，例如其效應(yīng)因子VgrG-1 靶向真核生物，可以引起巨噬細(xì)胞或捕食性阿米巴細(xì)胞毒性肌動(dòng)蛋白交聯(lián)，從而逃避捕食［3-5］。霍亂弧菌T6SS 基因簇由一個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的主基因簇（VC0105-VC0124）和至少3 個(gè)附軸（VCA0017-VCA0021、VCA1415-VCA1419 和 VCA0284-VCA0286）構(gòu)成［6］。有研究報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，將第七次霍亂流行的El Tor 菌株N16961、C6706 和海地變異菌株H1 的T6SS 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，H1 株T6SS有著更高的轉(zhuǎn)錄水平；尤其是T6SS 鞘蛋白（VipA，VipB）和鞘水解蛋白（ClpV）［5］。我們猜測(cè)基因vipA，vipB和clpV中是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控T6SS轉(zhuǎn)錄。雖然霍亂弧菌是研究T6SS 調(diào)控的模式菌株，但是霍亂弧菌會(huì)隨著環(huán)境的變化會(huì)快速產(chǎn)生適應(yīng)性突變。在2016 也門爆發(fā)近代史上最大的霍亂疫情，也門霍亂弧菌同樣為El Tor 霍亂弧菌的變種，同樣表現(xiàn)出更強(qiáng)的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度［7-8］。探索新發(fā)疫情細(xì)菌H1 的T6SS 調(diào)控機(jī)制對(duì)于深刻了解T6SS 對(duì)于病原菌致病性，以及在細(xì)菌進(jìn)化中的作用，有著重要意義。為了探索霍亂弧菌新發(fā)菌株H1 的T6SS 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，分析H1 株分別由于vipA敲除（H1ΔvipA），vipB敲除（H1ΔvipB）和clpV敲除（H1ΔclpV）時(shí)T6SS基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，并對(duì)其差異基因進(jìn)行了基因本體論（Gene ontology，GO）富集和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集。旨在分析H1 株中結(jié)構(gòu)相關(guān)基因與T6SS 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)性，完善霍亂弧菌T6SS 調(diào)控圖譜；H1 株的T6SS 調(diào)控對(duì)將T6SS 作為靶標(biāo)來(lái)防治霍亂弧菌等病原菌的傳害提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將霍亂弧菌H1 株wt 和突變株培養(yǎng)于添加終濃度為100 μg/mL 的鏈霉素的LB 培養(yǎng)基，37 ℃，1.4×g的搖床中培養(yǎng)；添加100 μg/mL的鏈霉素和1%瓊脂粉的LB 培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《生物安全保障承諾書(shū)》中的相關(guān)規(guī)定，按照標(biāo)準(zhǔn)操作展開(kāi)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，確保實(shí)驗(yàn)室安全。

1.2 主要試劑

載體（pWM91 Vector，實(shí)驗(yàn)室自存）；限制性內(nèi)切酶（NotI-HF 和SacI，NEB 公司）；連接酶（T4 DNA Ligase，NEB 公司）；Taq 酶（PrimeSTAR Max Premix，Takara 公司）；感受態(tài)（SM10 和DH5α λ pir，實(shí)驗(yàn)室自存）；TRIzol 試劑（TRIzol Reagent，Thermo公司）；RNA 提取試劑盒（Pure Link RNA Mini Kit，Invitrogen 公司）；DNA 清除試劑盒（Ambionogen-RNA Mini Kit，Invitrogen 公司）；RNA-seq 建庫(kù)試劑盒（Next? Ultra Ⅱ?Directional RNA Library Prep Kit for Illumina，NEB 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Evo MMLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR，艾科瑞公司）；熒光定量試劑盒（SYBR? Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit，艾科瑞公司）。

1.3 突變菌株構(gòu)建

選取目標(biāo)基因上下游各800 bp 的序列分別進(jìn)行擴(kuò)增，將上下游片段的黏性末端相連組成1 600 bp片段克隆到pWM91自殺質(zhì)粒中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至SM10 感受態(tài)中，并與H1 wt 于37 ℃共培養(yǎng)2 h；保證重組質(zhì)粒整合至H1菌株的基因組中完成第1 次同源重組。將完成第一次同源重組的H1 菌株在含有6%蔗糖的平板上涂布，由于重組質(zhì)粒攜帶sacB基因。迫于蔗糖的選擇壓力，此時(shí)發(fā)生第2 次同源重組，目標(biāo)基因被敲除突變菌株構(gòu)建完成。按照以上方法在H1 wt基礎(chǔ)上構(gòu)建H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV。

1.4 細(xì)菌總RNA提取

于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，取109CFU 細(xì)菌于1 mL 的TRIzol 中，加入250 mg 的玻璃砂，勻漿2 次每次1 min。加入400 μL 的氯仿于樣品中混勻，在4 ℃預(yù)冷離心機(jī)中13 200 ×g離心30 min。取水相上清，按照Pure Link RNA Mini Kit 說(shuō)明書(shū)提取總RNA，隨后根據(jù)Ambionink RNA Mini Kit 的說(shuō)明書(shū)去除樣品中的DNA，得到純化的總RNA 樣品。利用Nanodrop One，1%瓊脂糖電泳（120V，30 min）和Agilent 4200檢測(cè)RNA 樣品的完整性、純度和總量，合格者進(jìn)行接下來(lái)的測(cè)序分析。每個(gè)菌株重復(fù)3 次，作為3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將合格的RNA 樣品按照Next? Ultra Ⅱ?Directional RNA Library Prep Kit for Illumina 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 雙鏈合成和測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，利用Agilent 2100 對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估；合格的文庫(kù)通過(guò)llumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序得到RNA-seq 原始數(shù)據(jù)。CLC Workbench 12.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和過(guò)濾。將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)與從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載H1 wt 菌株的參考基因組文件進(jìn)行比對(duì)，得到測(cè)序片段計(jì)數(shù)矩陣并運(yùn)用TMM 的方法進(jìn)行均一化。最后以H1 wt 菌株轉(zhuǎn)錄組作為內(nèi)參獲得差異基因的表達(dá)矩陣，并用BH 方法對(duì)P-value 進(jìn)行矯正；以FDR＜0.01 且|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)定義差異基因。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)

利用熒光定量PCR 方法，對(duì)T6SS 基因簇中部分基因的RNA-seq 結(jié)果進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。RNA 樣品1 μg 按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系如下：2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL、cDNA 2 μL、上下游特異性引物（10 μmol/L）各0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、RNase free water 6.8 μL，引物序列均在NCBI 中驗(yàn)證。擴(kuò)增程序：95 ℃運(yùn)行30 s循環(huán)1次，95 ℃運(yùn)行5 s，60 ℃運(yùn)行30 s循環(huán)40次。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次，以gyrB作為管家基因，以H1 wt的CT值作為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，使用log2FC計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Hiplot（https：//hiplot.com.cn）對(duì)RNA-seq的差異基因進(jìn)行聚類分析、可視化分析和交叉關(guān)系展示。將H1 wt 基因組序列與eggNOG（http：//eggnog-mapper.embl.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到有GO和KO功能注釋的差異基因，并使用clusterProfiler R 進(jìn)行GO 和KEGG 富集。采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。

2 結(jié)果

2.1 H1ΔvipA，H1ΔvipB 和H1ΔclpV 的T6SS 基因簇轉(zhuǎn)錄水平不同

利用RNA-seq 技術(shù)，將H1 wt 轉(zhuǎn)錄組作為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi) 參，得 到H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的T6SS 基因簇log2FC 趨勢(shì)圖（圖1）。以|log2FC|≥1 為基準(zhǔn)，認(rèn)為有差異。由圖1 可知，H1ΔvipA株T6SS 主 軸vipB（log2FC=4.18）、hsiF（log2FC=4.28）、vasA（log2FC=3.59）、vasB（log2FC=3.71）、vasC（log2FC=3.91）、vasD（log2FC=3.81）、vasE（log2FC=3.41）、vasF（log2FC=3.58）、clpV（log2FC=3.39）、vasH（log2FC=3.38）、vasI（log2FC=3.71）、vasJ（log2FC=3.40）、vasK（log2FC=3.31）、vasL（log2FC=2.60）和vgrG-3（log2FC=1.51），以及T6SS 附軸hcp-1（log2FC=3.59）、vgrG-1（log2FC=1.62）、hcp-2（log2FC=3.45）和vgrG-2（log2FC=2.21）的轉(zhuǎn)錄水平都呈增高趨勢(shì)；僅vipA（log2FC=-11.78）轉(zhuǎn)錄水平由于敲除呈降低趨勢(shì)。H1ΔvipB株tsiV-3（log2FC=-1.23）、VC1420（log2FC=-1.06）和vipB（log2FC=-9.02）的轉(zhuǎn)錄水平呈降低趨勢(shì)，其余基因|log2FC|均小于1。H1ΔclpV株tsiH（log2FC=1.32）轉(zhuǎn)錄水平呈增高趨勢(shì)；僅clpV（log2FC=-8.45）轉(zhuǎn)錄水平由于敲除呈降低趨勢(shì)。

圖1 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV株的T6SS基因簇轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 The expression level of genes of T6SS clusters across H1ΔvipA，H1ΔvipB and H1ΔclpV

2.2 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV轉(zhuǎn)錄組分析

以H1 wt 轉(zhuǎn)錄組為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參，尋找由于vipA，vipB和clpV基因敲除引起的轉(zhuǎn)錄差異。以FDR＜0.01 且|log2FC|≥1 為標(biāo)準(zhǔn)定義差異表達(dá)基因，并且對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析（圖2A）。H1ΔvipA的差異基因共有22 個(gè)，其中19 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，3 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（圖2B）；H1ΔvipB的差異基因有44 個(gè)，其中17 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，27 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（圖2C）；H1ΔclpV的差異基因有86 個(gè)，其中49 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，35 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（圖2D）。并且H1ΔvipB和H1ΔclpV擁有相同的23 個(gè)差異基因；H1ΔvipB和H1ΔvipA有4 個(gè)相同的差異基因（hapA，hapR，vipB，KW3_RS0115980）；H1ΔvipA和H1ΔclpV有4 個(gè)相同的差異基因（hapA，hapR，clpV，KW3_RS0115980）；H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV共同擁有的差異基因有3 個(gè)（hapA，hapR，KW3_RS0 115980；圖2E）。

圖2 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV差異基因分析Fig.2 Differentially expressed genes across H1ΔvipA，H1ΔvipB and H1ΔclpV

2.3 H1ΔvipA，H1ΔvipB 和H1ΔclpV 的差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

以H1 wt 的GO 注釋作為基因背景，對(duì)H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的差異基因進(jìn)行GO 富集。H1ΔvipA的差異基因GO 富集通路主要涉及細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）、多機(jī)體過(guò)程（multi-organism process）、發(fā)病機(jī)制（pathogenesis）和物種間相互作用（interspecies interaction）等（圖3A）。H1ΔvipB的差異基因GO 富集通路主要涉及二甲基酸運(yùn)輸（dicarboxylic acid transport）、C4-二甲基運(yùn)輸（C4-dicarboxylate transport）、有機(jī)酸運(yùn)輸（organic acid transport）和有機(jī)離子運(yùn)輸（organic anion transport）等（圖3B）。H1ΔclpV的差異基因GO 富集通路主要涉及結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）、核糖體的結(jié)構(gòu)成分（structural constituent of ribosome）、肽代謝過(guò)程（peptide metabolic process）和肽生物合成過(guò)程（peptide biosynthetic process）等（圖3C）。

圖3 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV差異表達(dá)基因的GO富集Fig.3 GO enrichment of DEGs across H1ΔvipA，H1ΔvipB and H1ΔclpV

以H1 wt 的KEGG 注釋作為基因背景，對(duì)H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的差異基因進(jìn)行KEGG 富集。H1ΔvipA的差異基因KEGG 富集通路主要涉及霍亂弧菌生物膜形成（biofilm formation-Vibrio cholerae，圖4A）。H1ΔvipB的差異基因KEGG富集通路主要涉及布塔諾酸鹽代謝（butanoate metabolism）、雙組件系統(tǒng)（two-component system）、霍亂弧菌生物膜形成（biofilm formation-Vibrio cholerae）和酮體的合成和降解等（synthesis and degradation of ketone bodies，圖4B）。H1ΔclpV的差異基因KEGG 富集通路主要涉及硫銨代謝（thiamine metabolism）等（圖4C）。

圖4 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV差異表達(dá)基因的KEGG富集Fig.4 KEGG enrichment of DEGs across H1ΔvipA，H1ΔvipB and H1ΔclpV

2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

挑選T6SS 基因簇中部分基因以及hapR對(duì)H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行qPCR 驗(yàn) 證。H1ΔvipA的決定性系數(shù)為0.801 3；H1ΔvipB的決定性系數(shù)為0.816 5；H1ΔclpV的決定性系數(shù)為0.800 0，各個(gè)菌株T6SS 部分基因和hapR轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果基本一致（圖5）。

3 討論

為了探究霍亂弧菌H1 新發(fā)株T6SS 結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因是否調(diào)控T6SS 轉(zhuǎn)錄，我們構(gòu)建了多個(gè)T6SS 敲除株。通過(guò)H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的T6SS 轉(zhuǎn)錄水平比 較，發(fā)現(xiàn) 僅vipA缺 失，H1 株T6SS 下游基因整體轉(zhuǎn)錄水平顯著性增高，包括下游的vipB和clpV；與其共編碼VipA/VipB 鞘蛋白復(fù)合體的vipB缺失和編碼鞘蛋白水解酶的clpV缺失，T6SS 轉(zhuǎn)錄水平卻無(wú)整體變化。同時(shí)RNA-seq 的結(jié)果表示H1ΔvipA有22 個(gè)差異基因，其中有18 個(gè)屬于T6SS 基因簇（圖2B）。已有研究表明，霍亂弧菌的鞘蛋白是高度保守的，其同源物已在所有T6SS結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)；并且VipA 和VipB 蛋白相結(jié)合是保證T6SS 活性的必要條件。在霍亂弧菌O1 V1552 中，vipA缺失會(huì)導(dǎo)致VipB 不能穩(wěn)定產(chǎn)生［9］。在同樣擁有T6SS 的土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）中，vipA同源物基因的缺失，使vipB同源基因的轉(zhuǎn)錄水平下降兩倍，而vipB同源基因的缺失對(duì)vipA同源基因的轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)影響［10］。以往研究表明vipA與vipB轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)當(dāng)是相對(duì)穩(wěn)定的，而將vipA缺失vipB水平卻增高400 多倍（圖5），這種結(jié)果是從未報(bào)道過(guò)的。

圖5 H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV T6SS基因簇RNA-seq數(shù)據(jù)的qPCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of RNA-seq data of genes of T6SS clusters by qPCR across H1ΔvipA，H1ΔvipB and H1ΔclpV

H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV共同擁有的差異基因有3 個(gè)（hapR，hapA，KW3_RS0115980）（圖2E）。在霍亂弧菌中，HapR是一種群體感應(yīng)通路主要的調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)抑制霍亂弧菌多糖合成的調(diào)控基因vpsT及vpsR的表達(dá)，來(lái)抑制霍亂弧菌生物膜形成和毒力基因的表達(dá)；同時(shí)HapR 也可與T6SS附軸啟動(dòng)子結(jié)合，激活T6SS附軸的轉(zhuǎn)錄［11-13］。當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，磷酸化的LuxO 激活Qrr sRNA 產(chǎn)生，激活A(yù)phA 的翻譯并抑制HapR 的翻譯，從而降低T6SS 附軸的轉(zhuǎn)錄水平；Qrr sRNA 也可通過(guò)與T6SS主基因簇的mRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)直接抑制T6SS 主軸轉(zhuǎn)錄［14］。當(dāng)細(xì)胞密度較高時(shí)，LuxO 未磷酸化，Qrr sRNA 不轉(zhuǎn)錄，HapR 穩(wěn)定表達(dá)，此時(shí)T6SS 主軸中的調(diào)控因子vasH 與HapR 一起促進(jìn)T6SS 附軸轉(zhuǎn)錄［11］。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，H1ΔvipA株中hapR是轉(zhuǎn)錄差異基因，并呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)；而hapR在H1ΔvipB和H1ΔclpV中呈明顯增高趨勢(shì)（圖2B-D）。這提示我們，hapR可能參與H1 株中vipA對(duì)T6SS 基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并與vipA轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)一致。同時(shí)，vipA可以調(diào)控T6SS 轉(zhuǎn)錄水平可能由于vipA與其他T6SS主軸基因共用一個(gè)啟動(dòng)子［6］，并且vipA是T6SS主軸啟動(dòng)子后的第一個(gè)基因，可能作為反式作用因子結(jié)合阻遏蛋白，從而抑制后續(xù)T6SS基因簇轉(zhuǎn)錄。

HapA 是hapA編碼的金屬蛋白酶，是一種霍亂弧菌O1 分泌的輔助毒素。其通過(guò)水解宿主黏蛋白、降低宿主細(xì)胞間的緊密連接、水解宿主的免疫蛋白等放方式加速疾病進(jìn)程［15］。在霍亂弧菌中，hapA的轉(zhuǎn)錄由HapR和RpoS共同調(diào)控，在營(yíng)養(yǎng)受限或細(xì)胞密度較高時(shí)，群體感應(yīng)調(diào)控蛋白HapR 穩(wěn)定表達(dá)，從而直接激活hapA的轉(zhuǎn)錄［16］。本實(shí)驗(yàn)中hapA和hapR表達(dá)趨勢(shì)一致并且與野生型有顯著差異性，即 在H1ΔvipA中hapA（log2FC=-3.89）和hapR（log2FC=-8.00）表達(dá)共降低，H1ΔvipB中hapA（log2FC=2.46）和hapR（log2FC=3.16）表達(dá)共增高，且H1ΔclpV中hapA（log2FC=2.27）和hapR（log2FC=3.78）表達(dá)共增高，提示hapA的轉(zhuǎn)錄變化可能由hapR變化引起。而三個(gè)敲除株中KW3_RS0115980轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（圖2B-D），但其基因編碼蛋白目前僅預(yù)測(cè)為假想蛋白，其具體功能需要進(jìn)一步揭示。

ClpV 是由clpV編碼的ATP 酶，可通過(guò)水解VipA/VipB 鞘蛋白復(fù)合體，達(dá)到移除已收縮過(guò)的T6SS以啟動(dòng)新的T6SS分泌過(guò)程［17-18］。但將clpV敲除后，有多達(dá)86 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著改變，這些差異基因GO 富集到蛋白質(zhì)代謝相關(guān)通路（圖3C），KEGG 通路包括硫胺代謝通路（圖4C）。維生素B1又名硫胺素，是參與碳水化合物和氨基酸代謝的酶的輔因子，幾乎所有的生命體都需要硫胺素［19］。大多數(shù)細(xì)菌可以從頭合成硫胺素，當(dāng)缺乏硫胺素合成基因缺乏時(shí)則需要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從外界攝取硫胺素［20］。目前細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出許多硫胺素及前體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ThiBPQ、ThiXYZ、ECFThiT和YkoEDC）、二級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NiaP）和促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PnuT）。在H1ΔclpV中thiC、thiF、thiH和thiS呈明顯轉(zhuǎn)錄增高趨勢(shì)（圖2D）。thiC在硫胺素合成中起著重要作用，其編碼蛋白ThiC 將硫胺素和嘌呤合成的分支點(diǎn)代謝物5-氨基咪唑核糖苷轉(zhuǎn)化為磷酸化的4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶，這是合成有活性的焦磷酸硫胺素的關(guān)鍵［21］。有研究表示，在細(xì)菌、真菌和植物中硫胺素及其衍生物可以和RNA 結(jié)合以控制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯［22］。可見(jiàn)硫胺素在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面有著重要作用，但至于在霍亂弧菌中是否也有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能以及clpV缺失引起硫胺素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平升高，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

生物膜提供霍亂弧菌穩(wěn)定的生存環(huán)境，自然狀態(tài)下霍亂弧菌可以在浮游，單層生物膜中和成熟生物膜的生存狀態(tài)中切換，在不同的生存狀態(tài)下其體內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況不同［23］。H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的KEGG 均富集到霍亂弧菌生物膜形成相關(guān)途徑（圖4A-C），其中H1ΔvipA的生物膜形成相關(guān)差異基因有hapA、hapR、KW3_RS0 107715；H1ΔvipB的生物膜形成相關(guān)差異基因有hapA、hapR、tcpS、KW3_RS0103100 和KW3_RS0 103115；H1ΔclpV的生物膜形成相關(guān)基因有hapA、KW3_RS0116000、hapR、KW3_RS0103100 和KW3_RS0103115 等?；魜y弧菌生物膜形成過(guò)程受多種途徑調(diào)控，其中包括群體感應(yīng)途徑［24］。已有研究表明霍亂弧菌C6706中hapR的表達(dá)時(shí)間與生物膜厚度，生物膜脫離率和霍亂弧菌定植率密切相關(guān)［25］。H1ΔvipA，H1ΔvipB和H1ΔclpV的KEGG 富集不僅富集到霍亂弧菌生物膜形成通路還都富集到群體感應(yīng)通路，推測(cè)H1株中群體感應(yīng)調(diào)控生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：vipA基因是一個(gè)存在與H1 菌株中具有多重功能的基因，一是編碼T6SS鞘結(jié)構(gòu)蛋白，二是參與T6SS 調(diào)控。同時(shí)，研究表明hapR可能參與H1 菌株vipA對(duì)T6SS 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)合前期研究結(jié)果，將存在于H1 菌株中的可能調(diào)控通路繪制簡(jiǎn)圖（圖6）。本研究為將霍亂弧菌新發(fā)菌株H1 的T6SS 作為防治靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)；也為霍亂弧菌T6SS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供新的思路。

圖6 霍亂弧菌H1株T6SS轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.6 T6SS transcription regulation network in Vibrio cholerae H1