肝細(xì)胞性肝癌TACE后血清內(nèi)毒素、TOLL樣受體4和腸道微生態(tài)改變的實驗觀察

施長生，劉開才，呂維富，魯 東，周春澤，成德雷

腸道作為人體巨大的細(xì)菌庫，其微生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多變，通過肝腸軸，腸道與肝臟在解剖和功能上都存在密切的關(guān)系[1]。而目前從整合肝腸病學(xué)[2-3]的觀點看，腸道微生態(tài)的失衡可以通過免疫、代謝及營養(yǎng)等多種途徑影響肝臟病變的形成和發(fā)展，也可能是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)致癌的協(xié)同因素，即通過“肝腸軸”促進(jìn)肝細(xì)胞癌變的局部微環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)展。對于病人而言，慢性肝病不僅會造成腸道黏膜的損傷，還會導(dǎo)致腸道內(nèi)部菌群失調(diào)及其代謝異常[4-5]。肝動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)被認(rèn)為是不可切除肝癌的首選治療方案[6-7]。但是TACE治療肝癌后是否可以改善腸道菌群紊亂狀態(tài)，腸道微生態(tài)與TACE療效和病人生存獲益之間是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚，本研究觀察TACE治療肝癌后，病人血清中內(nèi)毒素(lipopolysaccharides,LPS)、TOLL樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)的變化情況，以及TACE術(shù)對腸道菌群的影響，現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3-6月中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院初診為HCC的11例病人相關(guān)資料，其中男9例，女2例;Child A級8例，B級3例;腫瘤中位直徑約7.2 cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HCC的診斷依據(jù)我國衛(wèi)生部《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)充分的肝功能儲備；(3)無腹水或少量腹水；(4)病人體力狀態(tài)ECOP評分≤2分；(5)膽紅素≤3 mg/dL；(6)血清白蛋白≥2 mg/dL；(7)無其他臟器重要疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾經(jīng)接受過任何TACE或經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞術(shù)(TAE)；(2)曾經(jīng)接受過外科分流手術(shù)或經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門-腔靜脈分流術(shù)；(3)影像學(xué)顯示肝臟彌漫性疾病或門脈主干癌栓；(4)病人抗生素治療中或結(jié)束不滿1周；(5)病程中服用微生態(tài)制劑相關(guān)治療。

1.2 TACE治療方法 采用改良Seldinger法穿刺股動脈，先對腹腔干及腸系膜上動脈進(jìn)行造影，通過造影來明確病人病灶的數(shù)量、位置及供給腫瘤的動脈。用微導(dǎo)管超選擇插入肝左、右動脈及其遠(yuǎn)段的腫瘤供血動脈，盡可能地避開正常肝組織供血支，先灌注洛鉑50～100 mg，再用碘油2～30 mL+吡柔比星20 mg混合乳劑栓塞腫瘤血管，碘油量視腫瘤大小和碘油沉積情況而定，但是不超過30 mL，最后用適量PVA顆粒栓塞[至血流停止，復(fù)查數(shù)字減影血管造影(DSA)腫瘤染色基本消失]。術(shù)后常規(guī)給予保肝、抑酸等治療3～5 d。

1.3 觀察指標(biāo)及其測定方法 觀察病人TACE術(shù)前、術(shù)后DSA情況及術(shù)后1個月影像表現(xiàn)，采用增強(qiáng)CT或MR檢測瘤體大小，近期療效鑒定采用改良的實體瘤治療療效評價標(biāo)準(zhǔn)(mRECIST標(biāo)準(zhǔn))[9]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)，客觀有效率(ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%。于術(shù)前1 d、術(shù)后1周和術(shù)后1個月，空腹采血及采取病人糞便，血液標(biāo)本置離心機(jī)中離心留取血清(3 000 r/min，離心10 min)且分裝，與糞便標(biāo)本同放置-80 ℃環(huán)境保存待測。之后成批檢測LPS、TLR4。LPS測定采用鱉試劑三肽顯色基質(zhì)偶氮法，試劑盒由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)院檢驗科提供。TLR4檢測采用ELISA方法，試劑盒為上海時代新光生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。腸道菌譜由微基生物科技(上海)有限公司通過二代高通量測序檢測，糞便樣本中微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN,Hilden,Germany)。選取16S rDNA的 V4-V5區(qū)序列進(jìn)行高通量測序分析。經(jīng)過相應(yīng)的處理從而得到優(yōu)化序列，之后進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)聚類(UPARSE software)，基于分類學(xué)信息，在門、綱、目、科、屬、種分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。利用mothur(Version 1.33.3)進(jìn)行Alpha多樣性分析(Chao、Ace等物種豐富度統(tǒng)計，Shannon、Simpson等物種多樣性統(tǒng)計)、VENN圖，Beta多樣性分析[(un)Weighted UniFrac分析]，利用R語言(Version 3.2.3)進(jìn)行Heatmap分析、PCA分析，CCA/RDA分析則采用CANOCO(Version 4.54)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用重復(fù)測量方差分析和Bonferroni兩兩比較。使用實時PCR將腸道菌群進(jìn)行量化處理，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)分析使用MIXED過程與R編程工具(3.3.0版)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤控制情況 術(shù)前增強(qiáng)CT或MR提示肝內(nèi)單發(fā)或多發(fā)強(qiáng)化灶，DSA示腫瘤染色明顯，富血供(8例)和中等血供(3例)，化療栓塞術(shù)后再次DSA，腫瘤染色基本消失(見圖1)。TACE術(shù)后1個月復(fù)查增強(qiáng)CT，腫瘤CR 2例，PR 6例，SD 3例，PD 0例，ORR為72.7%，DCR為100.0%。

2.2 研究血樣在不同時間點LPS、TLR4含量的變化 病人術(shù)前1 d、術(shù)后1周、術(shù)后1個月時血清內(nèi)LPS、TLR4含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Bonferroni兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)，LPS含量術(shù)前1 d低于術(shù)后1周及術(shù)后1個月，TLR4含量術(shù)后1個月低于術(shù)前1 d及術(shù)后1周，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 不同時間段病人血清LPS、TLR4含量比較

2.3 腸道菌群改變 分別檢測11位病人3個不同時間點糞便樣本，比較不同時間點病人大便樣品中群落的豐富度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人TACE術(shù)后1周腸道菌群豐度稍上升，但術(shù)后1個月時其豐度下降，并低于術(shù)前1 d腸道菌群水平。而基于分類學(xué)信息，在門、綱、目、科、屬、(或種)各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)病人術(shù)后1周內(nèi)擬桿菌等益生菌豐度比例下降，腸桿菌等變形菌門類潛在致病菌明顯增加，隨后1個月益生菌豐度增加，高于術(shù)后1周及術(shù)前1 d，同時致病菌豐度下降，低于術(shù)后1周及1個月。隨后進(jìn)一步通過單因素方差分析，顯示擬桿菌、毛螺菌等益生菌豐度高于術(shù)前1 d及術(shù)后1周，且鏈球菌、乳桿菌屬低于術(shù)前1 d及術(shù)后1周，且3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣進(jìn)行LDA EffectSize組間群落差異分析顯示擬桿菌、毛螺菌屬、梭形芽孢桿菌等益生菌與術(shù)前1 d、術(shù)后1周在諸水平中有明顯差異，從LDA條形圖中可以看出益生菌在該組病人腸道菌群中占主要影響因素(見表2、圖2)。

表2 組間的Alpha多樣性ACE指數(shù)差異分析的檢驗

3 討論

正常人體生理狀態(tài)下，菌群、宿主與環(huán)境之間保持動態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)長期慢性肝病狀態(tài)下，由于腸道菌群過度生長，腸黏膜屏障通透性改變，腸道菌群易位淤積的大量內(nèi)毒素作為病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，通過TLR4激活固有免疫系統(tǒng)，更進(jìn)一步加重肝臟的炎癥病態(tài)。80%～90%的HCC來源于肝臟慢性炎癥、肝硬化[10]，但在肝腸循環(huán)中腸道微生態(tài)如何對HCC產(chǎn)生影響尚不清楚。近年來，大量的研究也致力于信號傳導(dǎo)通路連接著腸道菌群與HCC。2010年YU等[10]通過動物實驗證實腸道內(nèi)毒素促進(jìn)HCC的發(fā)生，他們發(fā)現(xiàn)骨髓來源的肝臟Kuffer細(xì)胞是LPS的作用靶點，Kuffer細(xì)胞產(chǎn)生促炎調(diào)節(jié)因子腫瘤壞死因子α與IL-6通過LPS-TLR4信號通路產(chǎn)生了高分泌活化的促腫瘤細(xì)胞因子，激活了癌前肝細(xì)胞增殖。同樣DAPITO等[12]運用二乙基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)的小鼠模型進(jìn)一步闡釋了腸道菌群和TLR4在HCC發(fā)生中的特有作用，同時也證實了應(yīng)用抗生素清除腸道菌群可使高達(dá)90%HCC的發(fā)生進(jìn)展受到抑制。上述實驗結(jié)果又與WANG等[13]關(guān)于LPS誘導(dǎo)TLR4在原發(fā)性肝癌中轉(zhuǎn)導(dǎo)癌細(xì)胞存活和增殖的研究結(jié)果相符。

在肝腸循環(huán)中，HCC治療后是否會由于腫瘤得到有效控制，進(jìn)而對腸道菌群的變化有影響呢？本研究發(fā)現(xiàn)HCC病人行TACE術(shù)后1個月，腸道菌群的豐度有所下降，與術(shù)前、術(shù)后1周比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，而在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析及單因素方差分析顯示擬桿菌、毛螺菌屬等益生菌在TACE術(shù)后1周時豐度稍有下降，1個月后又明顯增加，而腸桿菌、鏈球菌等潛在致病菌豐度明顯下降，與病人術(shù)前、術(shù)后1周相比，諸類菌種豐度均有統(tǒng)計學(xué)意義，同時LEFSE分析指出TACE術(shù)后1個月擬桿菌科、毛螺菌屬、梭形狀的芽孢桿菌科等益生菌起重要影響作用。由此可見肝癌病人行TACE術(shù)后，其腸道菌群失調(diào)短暫加重后，繼有效改善，益生菌豐度及其影響作用有所提高。那么肝癌行TACE術(shù)是如何影響腸道微生態(tài)，具體作用機(jī)制可能如下：(1)肝癌病人常伴有肝硬化-門脈高壓[14]，TACE術(shù)能控制腫瘤惡化，進(jìn)而有效改善肝功能，降低門脈高壓，減緩因門脈高壓所致的腸壁淤血、水腫，加快小腸蠕動，改善腸道運動障礙，避免細(xì)菌過度繁殖。(2)當(dāng)癌細(xì)胞在肝內(nèi)有效被TACE術(shù)抑制后，肝細(xì)胞的膽汁排泄增加，肝臟分泌的結(jié)合型膽汁酸對腸道內(nèi)的細(xì)菌有抑制作用，而游離型膽汁酸在腸道內(nèi)可通過調(diào)節(jié)pH值而起到調(diào)節(jié)腸道的細(xì)菌群平衡的作用，從而間接影響到腸道菌群平衡[15]。(3)肝癌TACE術(shù)后，肝臟正常組織代償能力增加，肝臟清除內(nèi)毒素能力得以有效提高，減輕因為內(nèi)毒素血癥所導(dǎo)致的腸黏膜的炎性反應(yīng)，進(jìn)一步改善腸內(nèi)部的微循環(huán)，能夠有效促進(jìn)已經(jīng)損傷的腸黏膜的修復(fù)，減少腸壁細(xì)菌的移位[16-17]。

目前關(guān)于腸道菌群對肝癌的研究主要集中在LPS-TLR4，更多是PAMPs或DAMPs以及其他TLRs在肝腸軸中的作用。研究[10-19]發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌移位至肝臟部位后，其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS通過激活原位肝細(xì)胞中的TLR4，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。而伴隨著肝癌TACE術(shù)后腸道菌群的改變，肝腸軸間的信號傳導(dǎo)是否發(fā)生了相應(yīng)的變化，本研究進(jìn)一步對11例病人血清中LPS、TLR4進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)LPS及TLR4在術(shù)后1周有所升高，但在術(shù)后1個月明顯下降且低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，血清LPS及TLR4含量隨著腸道菌群變化而隨之波動。當(dāng)腸道菌群失調(diào)狀況改善時，內(nèi)環(huán)境中LPS及TLR4含量減少，意味著腸道微生態(tài)平衡的改善可以調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤發(fā)展的信號通路，降低TLR4表達(dá)，減少細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放導(dǎo)致的肝細(xì)胞慢性炎癥損傷，抑制癌基因的激活，發(fā)揮與原有治療手段協(xié)同的抗腫瘤效果。

綜上所述，肝癌TACE治療不僅能夠阻斷腫瘤血管，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，同時改善肝功能后還可以調(diào)整腸道菌群，減少內(nèi)毒素水平，有利于病人的預(yù)后。目前已有腸道微生態(tài)療法對肝癌介入治療后作用的研究，但其臨床療效不夠明確及穩(wěn)定，本研究通過高質(zhì)高效的高通量測序宏基因技術(shù)，為微生態(tài)制劑的篩選提供了細(xì)致的菌群分析結(jié)果。進(jìn)一步加強(qiáng)了臨床對于微生態(tài)制劑菌種的篩選。