白果內(nèi)酯通過NLRP3相關通路發(fā)揮對乙醇致大鼠胃潰瘍的保護作用

劉廣寧, 門 煒

劉廣寧, 南開大學附屬醫(yī)院(天津市第四醫(yī)院)消化科 天津市 300000

門煒, 天津大學北洋門診部 天津市 300000

劉廣寧, 主治醫(yī)師, 研究方向為中西醫(yī)結(jié)合消化疾病的診療.

0 引言

胃潰瘍(gastric ulcer, GU)是常見的慢性消化系統(tǒng)疾病, 由于胃黏膜被消化液消化引起的黏膜肌層組織損傷現(xiàn)象. 過量飲酒會引起腹部燒灼樣疼痛, 嘔吐及嘔血等急性胃潰瘍臨床癥狀. 幾年來隨著生活水平的提高, 飲酒人數(shù)逐年增加, 導致胃潰瘍患者的新發(fā)病例也明顯上升. 目前研究結(jié)果表明, 胃潰瘍患者的胃黏膜的防御系統(tǒng)遭到破壞后會引發(fā)機體內(nèi)發(fā)生潰瘍相關的炎癥反應, 使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達量明顯升高, 同時血清中會釋放大量促炎性細胞因子. 胃潰瘍的發(fā)生主要與MAPK通路、ERK通路、EGFR/ERK信號轉(zhuǎn)導途徑以及bFGF因子活化等有關. NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 在機體發(fā)生病變或應激刺激后在炎癥反應和細胞死亡過程中發(fā)揮著重要的作用. NLRP3炎癥體復合物主要由NOD樣受體(NOD-like receptor, NLRs)家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和效應蛋白半胱氨酸蛋白酶-1 (Caspase-1)組成, 當機體受到外界刺激時, CARD(caspase- activating and recruitment domain)感受器信號傳遞給ASC蛋白, 激活Caspase-1, 進而活化的IL-1β, 最終使上皮細胞釋放大量炎癥因子. 有研究指出, NLRP3相關通路在腸道菌群平衡, 腸炎及腸道腫瘤等腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用. 但目前關于NLRP3相關通路在胃潰瘍中的相關作用及其機制研究較少.

目前主要采用藥物對胃潰瘍患者進行治療, 常用的藥物有奧美拉唑和蘭索拉唑等質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、幽門螺旋桿菌抗生素等. 但這些藥物對胃潰瘍的治療效果有限, 還存在明顯的副作用. 白果內(nèi)酯(bilobalide, BI)是提取自銀杏葉的萜內(nèi)酯類化合物, 白果內(nèi)酯對精神病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有顯著的作用, 同時還可降低腦出血及腦水腫發(fā)生的概率. 同時有研究指出, 白果內(nèi)酯通過抑制活性氧和含氮物質(zhì)的表達量使得結(jié)腸炎大鼠血清中的TNF-α明顯降低, 最終使炎癥反應受到抑制, 對結(jié)腸黏膜具有一定的保護作用. 胃潰瘍胃黏膜損傷主要是通過炎癥因子及氧化應激途徑進行調(diào)控的, 白果內(nèi)酯對胃潰瘍胃黏膜損傷有一定的保護作用, 但其具體作用機制還有待進一步研究.

綜上所述, 我們推測在腸道疾病中發(fā)揮重要作用的NLRP3相關通路在胃潰瘍中發(fā)揮著重要的作用, 且白果內(nèi)酯對炎癥因子的調(diào)控可能與胃潰瘍的保護作用具有一定的相關性. 基于這種推測, 本文以60只SD大鼠為研究對象, 構(gòu)建了乙醇誘導的急性胃潰瘍模型, 研究白果內(nèi)脂通過NLRP3相關通路對乙醇誘導的急性胃潰瘍的作用及其具體的分子機制, 以為胃潰瘍的治療提供可參考的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組: 選擇60只6-7周齡的健康SD大鼠, 體重208-254 g, 雌雄各半; 每籠5只飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房, 室溫25 ℃±2 ℃, 相對濕度55%左右, 12晝夜交替, 自由飲水和飲食. 所有大鼠適應性飼養(yǎng)1 wk后進行試驗. 隨機分為六組: 空白組(A組), 模型組(B組), 對照組(C組), 低劑量組(D組)、中劑量組(E組)和高劑量組(F組), 每組10只, A組大鼠不作任何處理, B組建立乙醇誘導的急性胃潰瘍模型, C組大鼠造模后采用奧美拉唑進行治療, D組、E組和F組大鼠均在造模后采用不同劑量的白果內(nèi)酯進行治療. 本試驗所有動物程序均經(jīng)實驗動物管理委員會批準, 實驗方法均按照批準指南進行.

1.2 方法 乙醇誘導的急性胃潰瘍模型建立及試驗動物處理方法: 實驗前對所有大鼠禁食24 h, 禁水4 h. 以0.2 mL/kg的劑量對大鼠進行灌胃, 灌胃成功5 min內(nèi)可見大鼠出現(xiàn)全身癱軟、精神緊張、呼吸心跳加速等癥狀. 灌胃4 h內(nèi)禁食禁水, 4 h后可見大鼠出現(xiàn)身體癱軟癥狀, 則表明急性胃潰瘍模型構(gòu)建成功.

術后常規(guī)飼養(yǎng)1 d后開始給藥, C組以灌胃的方式給予濃度為20 mg/mL 的奧美拉唑(omeprazole, OME)進行治療. BI注射液臨床成人用量為 30-50 mg/(人d), 按50 mg/(人d)計算, 分別對大鼠給與臨床成人用量的2倍(1 mg/mL), 5倍(2.5 mg/mL)和10倍(5 mg/mL)進行試驗. D組給予濃度為1 mg/mL的BI進行治療, E組給予濃度為2.5 mg/mL的BI進行治療; F組給予濃度為5 mg/mL的BI進行治療. 所有動物均為每日給藥1次, 連續(xù)給藥14 d.

潰瘍指數(shù)計算及生化指標檢測: 造模成功3 h后, 用3%的戊巴比妥以1 g/kg劑量經(jīng)腹腔注射麻醉處死大鼠, 腹正中切口進入腹腔分離胃, 用注射器將胃液吸出, 采用0.5-5.0的精密pH試紙測定胃酸pH值. 以放射免疫分析法采用胃泌素檢測試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司)對不同組別大鼠胃泌素進行檢測. 采用胃蛋白酶檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)檢測胃蛋白酶活性.

造模成功后4 h, 采用眼眶取血的方法收集標本, 于4 ℃, 于4攝氏度, 3500 rpm條件下離心20 min, 收集上清, 分別采用不同的試劑盒根據(jù)具體操作步驟檢測血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(monochrome display adapter, MDA)和還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量. SOD、MDA和GSH檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所. 采用無菌釆血管取不同組別大鼠腹主動脈血約5 mL, 于室溫條件下放置20 min使血液自然凝固, 于3000 rpm/min條件下20 min取血清, 依據(jù)Elisa檢測試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)于450 nm波長下分別檢測血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達量.

分離胃后用生理鹽水沖洗胃腔內(nèi)及粘膜上的血跡, 將胃平鋪于濾紙上, 觀察胃黏膜潰瘍、糜爛及出血點發(fā)生的部位. 參考Wang等(2020)方法按照潰瘍或糜爛面積大小計算潰瘍指數(shù)(ulcer index, UI), 3個點狀潰瘍(粘膜缺損小于1 mm)計1分; 游標卡尺測量條狀出血潰瘍面寬為1 mm者計1分, 2 mm者計2分, 3 mm者計3分. 點狀潰瘍和條狀出血潰瘍面之和即為UI.

大鼠胃組織病理學觀察: 收集部分胃組織采用HE染色法其進行形態(tài)觀察. 將胃組織采用福爾馬林進行固定, 石蠟包埋, 連續(xù)切片4 um, 置于二甲苯30 min脫蠟-不同梯度酒精水化50 min-蘇木精沖洗20 min-水洗后伊紅染色2 min-梯度酒精脫水30 min-二甲苯透明20 min后, 采用中性樹膠封片, 在光鏡下觀察衛(wèi)組織病理改變. 采用經(jīng)典的病理炎癥細胞評分對胃組織白細胞浸潤程度進行評價, 白細胞浸潤程度分為5個等級, 0-1為無細胞或少數(shù)細胞, 2為一環(huán)1個細胞, 3為一環(huán)2-4個細胞, 4為一圈細胞超過4個細胞層.

NLRP3相關通路因子實時熒光定量PCR檢測: 取約20 g的胃組織, 放入勻漿器中, 盡量剪碎, 采用TRIzol法提取胃組織中的總RNA, 對提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 采用HifairⅢ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)進行反轉(zhuǎn)錄. 依據(jù)NCBI中各基因的mRNA序列合成不同因子的引物序列. NLRP3基因?qū)崟r熒光定量PCR引物: NL-F: 5’-CTGCATGCCGTATCTGGTTG-3’; NL-R: 5’-GGTACCCCATAGACTGGCAC-3’. IL-1β基因?qū)崟r熒光定量PCR引物. IL-F: 5’-AGGCTGACAGACCCCAAAAG-3’; ILR: 5’-CTCCACGGGCAAGACATAGG-3’. 以β-actin作為內(nèi)參, β-actin基因的引物Fa: 5’-ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’; Ra: 5’-CTGACCCATACCCACCATCAC-3’. 每個樣品作三個復孔, 退火溫度為60 ℃, 退火時間15 s, 30個循環(huán). 采用2法計算各因子的相對表達量.

免疫印跡(western blot, WB)法檢測NLRP3相關通路因子表達量: 取收集的胃組織放入勻漿器中, 盡量剪碎, 加入1 mL提前配置好的裂解液(RIPA蛋白裂解液:蛋白酶抑制劑PMSF = 1:100)進行研磨, 使組織充分裂解以提取總蛋白. 提取的總蛋白采用比辛尼酸法測定蛋白含量. 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白, 采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上, 然后用5%的脫脂牛奶進行封閉. 分別加入以1:1000比例稀釋好的NLRP3、白介素-18(IL-1β)、Caspase-1、調(diào)亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)和β-actin的抗體, 于4 ℃孵育過夜. 用TBST徹底洗滌3次, 10 min/次, 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下孵育2 h; 用TBST徹底洗滌3次, 10 min/次, 加入顯色液, 在顯影儀上自動曝光, 拍照進行灰度掃描. 根據(jù)灰度值分析蛋白表達量.

免疫熒光法檢測NLRP3蛋白表達量: 將不同組別大鼠胃組織, 依次用預冷的PBS和預冷的4%多聚甲醛進行灌注, 固定胃組織脫水并切片(約5-7 μm). 室溫下干燥30 min, 用PBS洗滌3次后用5%牛血清(含0.3%Triton X-100)進行1 h封閉. 加入FITC標記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體, 低溫孵育過夜. 用PBS洗滌3次, 加入熒光標記的二抗在室溫下孵育2 h. Iba-1染色10 min, 封片. 采用激光掃描共焦顯微鏡拍照.

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析, 計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示, 服從正態(tài)分布的計量資料采用單因素方差分析法(ANOVA), 差齊時兩組間比較采用LSD法, 方差不齊則采用Dunnett T3法檢驗; 不服從正態(tài)分布的計量資料采用秩和檢驗. 計數(shù)資料采用百分率表示,＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和胃液指標比較 對不同組別大鼠UI進行比較分析(圖1A), B組UI與A組相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組的UI與A組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05), 與B組相比具有顯著性差異(＜0.01). B組, C組, D組, E組和F組大鼠的胃液pH值與A組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05).

進一步對不同組別大鼠的胃泌素、總酸度以及胃蛋白酶活性進行檢測與分析(圖1B), A組胃泌素高于B組異(＜0.05). C組, D組, E組和F組大鼠的胃泌素明顯低于B組, 組間相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05). B組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性均明顯高于A組, 二者相比均具有顯著性差異(＜0.01). C組和E組和F組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比均具有顯著性差異(＜0.01). D組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05).

圖1 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和胃液指標比較. A: 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)及胃液pH值比較; B: 不同組別大鼠胃泌素、總酸度以及胃蛋白酶活性比較. (aP＜0.05; bP＜0.01; dP＜0.05; eP＜0.01). UI: 潰瘍指數(shù).

2.2 不同組別大鼠血清生化指標檢測結(jié)果分析 對不同組大鼠血清中SOD、MDA和GSH含量進行檢測, 結(jié)果如圖2所示, A組的SOD值明顯高于B組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), 經(jīng)給藥治療后, C組, D組, E組和F組大鼠血清中SOD值較B組明顯升高(＜0.01). A組的GSH值明顯高于B組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), 經(jīng)給藥治療后的C組, D組, E組和F組大鼠血清中GSH值較B組明顯升高, 組間相比均具有顯著性差異(＜0.01). B組大鼠MDA值明顯高于A組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), C組, D組, E組和F組大鼠血清中MDA與B組相比明顯降低(＜0.01).

圖2 不同組別大鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛和還原型谷胱甘肽含量比較. bP＜0.01; eP＜0.01. SOD: 超氧化物歧化酶; MDA: 丙二醛; GSH: 還原型谷胱甘肽.

2.3 血清中NLRP3相關通路因子表達量分析 對不同組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量檢測結(jié)果進行分析(圖3), B組大鼠血清中NLRP3的含量明顯高于A組, 二者相比具有極顯著性差異(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中NLRP3含量均低于B組相比均明顯降低(＜0.01). D組和E組大鼠血清中NLRP3含量與C組相比均具有統(tǒng)計學差異(＜0.05). B組大鼠血清中Caspase-1的含量明顯高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中Caspase-1含量均低于B組相比均明顯降低(＜0.01). D組, E組大鼠血清中Caspase-1含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計學差異(＜0.05), C組和F組大鼠血清中Caspase-1含量相比無統(tǒng)計學差異. B組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量均高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量均低于B組(＜0.01). D組, E組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計學差異(＜0.05), C組和F組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量相比無統(tǒng)計學差異.

圖3 不同組別大鼠血清中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量比較. cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05.

2.4 大鼠胃黏膜組織形態(tài)觀察 對不同組大鼠的胃黏膜組織形態(tài)進行觀察(圖4), A組大鼠胃壁完整、未見明顯損傷, B組大鼠胃部可見明顯的充血腫脹, C組, D組, E組和F組大鼠損傷程度明顯較B組減輕.

圖4 不同組別大鼠胃黏膜組織形態(tài). A: A組胃黏膜組織形態(tài); B: B組胃黏膜組織形態(tài); C: C組胃黏膜組織形態(tài); D: D組胃黏膜組織形態(tài); E: E組胃黏膜組織形態(tài); F: F組胃黏膜組織形態(tài).

對不同組大鼠胃組織病理學檢測結(jié)果進行分析(圖5), A組大鼠胃組織HE染色后可見胃黏膜結(jié)構(gòu)整齊, 未見炎細胞浸潤; B組大鼠胃組織HE染色可見胃黏膜上皮層缺失, 部分胃上皮細胞脫落, 出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤現(xiàn)象, C組, D組, E組和F組大鼠經(jīng)治療后胃上皮細胞脫落數(shù)量及炎癥細胞浸潤均減少. 對不同組別大鼠炎癥細胞評分結(jié)果進行分析, B組大鼠炎癥細胞評分值明顯高于A組, 二者相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組大鼠炎癥細胞評分值明顯低于B組, 組間相比均具有顯著性差異(＜0.01).

2.5 NLRP3相關通路因子RT-PCR檢測結(jié)果分析 對提取的RNA進行電泳檢測與分析(圖6A), 提取的RNA均有明顯的28S和18S RNA條帶, 條帶清晰可見未見明顯的降解, 表明提取的RNA完整, 進一步對不同組別大鼠組織中NLRP3和IL-1β的表達量進行比較分析(圖5B), B組大鼠胃組織中NLRP3的mRNA相對表達量明顯高于A組(＜0.01). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3的mRNA相對表達量與B組相比均明顯降低(＜0.01). B組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對表達量明顯高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對表達量與B組相比均明顯降低(＜0.01), D組, E組和F組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對表達量與C組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05).

圖5 不同組別大鼠胃黏膜組織形態(tài). A: A組胃黏膜組織HE染色; B: B組胃黏膜組織HE染色; C: C組胃黏膜組織HE染色; D: D組胃黏膜組織HE染色; E: E組胃黏膜組織HE染色; F: F組胃黏膜組織HE染色; G: 不同組別大鼠胃黏膜組織炎癥細胞評分結(jié)果比較. (cP＜0.001; eP＜0.01).

圖6 不同組別大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的表達量比較. A: 胃組織RNA電泳圖; B: 不同組別大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的表達量比較. (cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05). NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3.

2.6 NLRP3相關通路因子表達量分析 采用WB對不同組別大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量進行分析(圖7), A組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量均明顯低于B組(＜0.001). 經(jīng)治療后C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量均明顯低于B組(＜0.01). D組, E組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量與F組和C組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05), F組和C組胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量與F組和C組相比無統(tǒng)計學差異(＞0.05).

圖7 不同組別大鼠胃組織中NLRP3相關通路蛋白表達量比較. A:不同蛋白免疫印跡電泳圖; B: 不同組別大鼠胃組織中NLRP3相關通路蛋白表達量比較. (cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05). NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3; ASC: 調(diào)亡相關斑點樣蛋白. NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3.

2.7 免疫熒光檢測胃組織中NLRP3表達量 采用免疫熒光染色法對不同組別大鼠胃組織中NLRP3表達量進行分析(圖8), A組大鼠胃組織中幾乎沒有NLRP3表達, B組大鼠胃組織可見大量NLRP3表達, 經(jīng)給藥后的D組和E組大鼠胃組織中NLRP3表達量明顯降低, C組和F組大鼠胃組織中NLRP3表達量與A組相似, 表達量較低.

圖8 不同組別大鼠胃組織中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3表達免疫熒光圖.

2.8 NLRP3 相關通路因子間相關性分析 不同組別大鼠的NLRP3 相關通路因子間相關性進行分析(圖9), Caspase-1表達量對著NLRP3表達量的增加而增加, 即Caspase-1表達量與NLRP3表達量呈明顯正相關(R = 0.845,＜0.01); IL-1β表達量隨著 Caspase-1 表達量的增加而增加, 即IL-1β表達量與Caspase-1表達量呈明顯正相關(R = 0.903,＜0.01).

圖9 NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3相關通路因子間相關性分析. A: Caspase-1與NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3表達量相關性分析; B: IL-1β和Caspase-1表達量相關性分析. NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3.

3 討論

胃潰瘍是由氧自由基等多種因素引發(fā)的一種常見胃腸道疾病. 大量乙醇攝入是引發(fā)胃潰瘍的原因之一, 乙醇對胃黏膜的損傷是一個復雜的過程, 大量攝入乙醇會使胃黏膜上皮細胞和粘液層受損, 胃黏膜血流動力學的改變, 同時還可誘導胃黏膜合成和分泌多種炎癥及氧化應激等細胞因子, 進一步加劇胃黏膜的損傷. 本文采用白果內(nèi)脂對乙醇有道的大鼠胃潰瘍進行治療, 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), B組UI與A組相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組的UI與B組相比具有顯著性差異＜0.01). B組, C組, D組, E組和F組大鼠的胃液pH值與A組相比具有統(tǒng)計學差異(＜0.05). A組胃泌素明顯低于B組(＜0.05). B組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性均明顯高于A組(＜0.01). C組和E組和F組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比均具有顯著性差異(＜0.01). 這些結(jié)果表明, 經(jīng)乙醇誘導胃潰瘍大鼠胃黏膜指數(shù)、總酸度以及胃蛋白酶活性明顯升高, 胃液pH值和胃泌素明顯降低. 表明灌入的乙醇直接破壞了大鼠胃表面的保護屏障, 導致胃黏膜損傷. 乙醇誘導的胃潰瘍粘膜損傷病理特點與人體大量攝入酒精導致的胃黏膜損傷相似, 且這種造模方法簡便, 速度快, 重復性好. 同時可以看出, C組, D組, E組和F組的UI和胃液pH值與B組相比均有明顯的改善, 表明采用不同的藥物治療后可改善乙醇誘導胃潰瘍引發(fā)的胃黏膜指數(shù)、總酸度以及胃蛋白酶活性升高, 胃液pH值和胃泌素降低現(xiàn)象.

NLRP3炎癥體復合體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成, NLRP3主要作為感受器發(fā)揮作用, 將信號傳遞給效應蛋白Caspase-1, 活化的IL-1β和IL-18, 進而調(diào)控慢性炎癥. ASC接頭蛋白促進NLRP3炎癥體的激活. 而且IL-1β和IL-18的表達與免疫調(diào)節(jié)具有相關性, IL-1β和IL-18等炎癥因子的過量表達, 會引起機體免疫調(diào)節(jié)紊亂. 文中進一步對BI對問潰瘍的治療效果及其對應的分子機制進行探討, 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), B組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量均高于A組(＜0.01). D組, E組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計學差異(＜0.05). B組大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的mRNA相對表達量明顯高于A組(＜0.01). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP和IL-1β的mRNA相對表達量與B組相比均明顯降低(＜0.01). 這些結(jié)果表明乙醇的攝入使大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達均明顯升高, 經(jīng)白果內(nèi)脂治療后, 大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達量下調(diào). 說明白果內(nèi)脂通過調(diào)控炎癥反應相關分子NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達量對對乙醇誘導的胃潰瘍發(fā)揮了保護作用. Abdellatif等(2019)研究指出, 羅格列酮通過炎癥因子的調(diào)控參與了乙醇引發(fā)的胃潰瘍的調(diào)控過程, 本文研究結(jié)果與其相似. Caspase-1蛋白是NLRP3相關通路中促炎性細胞因子的調(diào)控因子. 同時有研究指出炎癥因子的表達量與潰瘍的嚴重程度呈正相關性. 文中結(jié)果發(fā)現(xiàn), 乙醇誘導胃潰瘍大鼠胃黏膜指數(shù)升高, 炎癥因子NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達量升高, 而經(jīng)BI和OME治療的大鼠胃黏膜指數(shù)下降, 且其NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達量較B組明顯下降, 這與目前炎癥因子的表達量與潰瘍的相關性結(jié)果一致. A組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量均明顯低于B組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達量均明顯低于B組(＜0.01). 可以看出, 在檢測的所有指標中F組明顯優(yōu)于陽性對照C組, 具有潛在的應用價值. NLRP3相關通路因子參與了白果內(nèi)脂對胃潰瘍的保護, 通過抗炎作用達到改善胃潰瘍的作用.

4 結(jié)論

本文通過構(gòu)建乙醇誘導的急性胃潰瘍模型, 并采用不同劑量的白果內(nèi)脂進行治療, 探討白果內(nèi)脂改善胃潰瘍的分子機制. 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 給藥白果內(nèi)脂后, 乙醇誘導的急性胃潰瘍大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β及ASC因子及蛋白的表達量明顯降低, 有效改善了胃潰瘍. 但是本文還存在一些不足之處, 本文僅對白果內(nèi)脂對乙醇誘導的急性胃潰瘍保護的NLRP3相關通路因子進行了研究, 未對其它通路進行分析, 尚不明確白果內(nèi)脂是否通過其它通路對乙醇誘導的急性胃潰瘍產(chǎn)生了相應的保護機制, 在今后的工作中將進一步對胃潰瘍保護相關通路進行研究, 以完善白果內(nèi)脂的作用機制. 綜上所述, NLRP3相關通路因子參與了白果內(nèi)脂對胃潰瘍的保護, NLRP3相關通路通過抗炎作用達到改善胃潰瘍的作用.

目前研究發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)脂可能對胃潰瘍具有一定的保護作用, 但其作用機制尚不明確, NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)相關通路在腸炎及腸道腫瘤等腸道疾病中具有重要的作用, 但其在胃潰瘍中的相關作用研究較少.

基于目前研究我們推測在腸道疾病中發(fā)揮重要作用的NLRP3相關通路可能在胃潰瘍發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用, 且白果內(nèi)酯對炎癥因子的調(diào)控可能與胃潰瘍的保護作用具有一定的相關性.

研究白果內(nèi)脂通過NLRP3相關通路對乙醇誘導的急性胃潰瘍的作用及其具體的分子機制, 以為胃潰瘍的治療提供可參考的理論依據(jù).

本文以60只SD大鼠為研究對象, 構(gòu)建了乙醇誘導的急性胃潰瘍模型, 以奧美拉唑作為陽性對照, 分析不同劑量白果內(nèi)酯對急性胃潰瘍的胃液pH值、胃泌素、胃蛋白酶、潰瘍指數(shù)(ulcer index, UI)、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、超氧化物歧化酶、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和還原型谷胱甘肽等因子含量的影響.

醇誘導的急性胃潰瘍模型大鼠UI、胃泌素、總酸度和胃蛋白酶總活性、MDA值、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白的mRNA水平和蛋白表達量均明顯升高. 經(jīng)奧美拉唑和不同劑量白果內(nèi)酯治療后的乙醇誘導胃潰瘍大鼠胃泌素、總酸度、胃蛋白酶總活性、MDA值、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白的mRNA水平和蛋白表達量均明顯較未治療模型組降低.

白果內(nèi)脂可通過NLRP3通路抗炎機制達到胃潰瘍的保護作用.

本文為胃潰瘍的治療提供了新思路, 在今后的工作中將進一步分析白果內(nèi)脂對乙醇誘導的急性胃潰瘍保護作用除了NLRP3通路是否還有其他通路參與.