牛副流感病毒3 型研究進(jìn)展

蔣磊

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

1 前言

由牛副流感病毒3 型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）引起的牛副流行性感冒（簡(jiǎn)稱牛副流感），是一種牛的急性接觸性呼吸道傳染病,廣泛流行于世界各國(guó),如美洲、歐洲、亞洲的多個(gè)國(guó)家均有牛副流感的發(fā)生或流行[1-3]。近20 年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)呈跨越式發(fā)展，但隨之而來(lái)的是疫病頻發(fā)，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)是牛群中的常見(jiàn)病及多發(fā)病，通常是由多種因素（細(xì)菌，病毒和環(huán)境等）共同作用引起的，而牛副流感病毒3型（BPIV3）就是其中最重要的病毒性病原之一[4]。

自1959 年Hoerlein 和Reisinger 等首次從牛中分離到BPIV3 以來(lái)，對(duì)于BPIV3 的病原學(xué)、診斷方法以及防控措方面的研究在逐步地發(fā)展與完善[5-6]。在以往的研究當(dāng)中，對(duì)于病毒粒子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及病毒基因組的構(gòu)成都有了較為完整的闡述，而病毒的基因型也一直分為a、b 這兩種類型[7]。直至2011 年，有研究者發(fā)現(xiàn)在我國(guó)分離到的一株BPIV3毒株與以往的a 基因型或b 基因型毒株有很大差異，由此BPIV3 產(chǎn)生了第三種基因型：c 型[8]。在致病機(jī)制的研究方面，目前有關(guān)副黏病毒的感染及其致病機(jī)制的研究較多，但對(duì)體內(nèi)被感染細(xì)胞的損傷機(jī)制研究卻很少。利用可以表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP） 的重組BPIV3 病毒，可以準(zhǔn)確定位BPIV3 病毒在動(dòng)物組織中的分布。然而，除了僅具有提示意義的形態(tài)學(xué)觀察，目前尚無(wú)明確證據(jù)表明由BPIV3 感染引起相關(guān)病理性變化的具體機(jī)制[9]。因此弄清由BPIV3 感染而造成細(xì)胞損傷的分子機(jī)制對(duì)于BPIV3 的預(yù)防和控制也具有十分重要的意義。對(duì)于牛副流行性感冒來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的診斷方法是臨床綜合診斷（流行病學(xué)診斷、臨床診斷、病理解剖學(xué)診斷）加病毒的分離鑒定和血清學(xué)檢查，現(xiàn)在隨著基因技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法等也逐步應(yīng)用于BPIV3 的快速、定量檢測(cè)。未來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的診斷方法將會(huì)應(yīng)用到BPIV3 的檢測(cè)中來(lái)，這對(duì)于牛副流感的防治將會(huì)起到十分重要的作用。

在我國(guó)動(dòng)物傳染病的防疫過(guò)程當(dāng)中一直貫徹“預(yù)防為主”的方針，在搞好飼養(yǎng)管理、防疫衛(wèi)生的前提下，預(yù)防接種也是非常重要的一環(huán)。國(guó)際上對(duì)于BPIV3 疫苗的研發(fā)和使用已經(jīng)有了較為寶貴的經(jīng)驗(yàn)。滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗的相關(guān)研究逐步完善，也有某些相關(guān)的產(chǎn)品問(wèn)世，并且這些產(chǎn)品的使用效果也已經(jīng)在實(shí)踐當(dāng)中得到了反饋。但對(duì)于核酸疫苗的研發(fā)還有待于提高，如何消除外源基因整合到宿主基因組的潛在威脅是制約核酸疫苗發(fā)展的最大因素。而在我國(guó)對(duì)于BPIV3 疫苗的研發(fā)和使用還處于十分落后的狀態(tài)，大大影響了我國(guó)對(duì)于牛副流感的防控效果。因此對(duì)于BPIV3 有效疫苗的研發(fā)和使用是急需解決的重要問(wèn)題。

近年來(lái),在我國(guó)的多個(gè)省份，如山東、內(nèi)蒙古、黑龍江等，都有犢牛呼吸道疾病綜合癥的發(fā)生，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查和病原學(xué)檢測(cè)的結(jié)果表明BPIV3 在這些犢牛呼吸道疾病綜合癥的病例中起到十分重要的作用。而且有研究表明,我國(guó)某些地區(qū)BPIV3 的血清陽(yáng)性率超過(guò)70%[10,11]。因此對(duì)于BPIV3 的預(yù)防和治療應(yīng)引起高度重視,否則將嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文就我國(guó)BPIV3 的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷方法、防控措施等方面的研究進(jìn)展作一綜述，為牛副流感病毒的基礎(chǔ)性研究以及相關(guān)的牛呼吸道疾病的防控提供參考。

2 病原學(xué)特點(diǎn)

BPIV3 為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、呼吸道病毒屬。完整的病毒粒子呈多形性，其中球形居多，病毒粒子的平均直徑約為150～200 nm。由于病毒粒子具有囊膜結(jié)構(gòu)（主要由蛋白和脂質(zhì)組成），因此BPIV3 對(duì)于有機(jī)溶劑十分敏感，如乙醚、氯仿等[10,12]。BPIV3 對(duì)多種動(dòng)物的紅細(xì)胞都有凝集作用，如牛、雞、豚鼠等，所以能夠通過(guò)血凝抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)BPIV3 進(jìn)行鑒定[13]。

BPIV3 的基因組全長(zhǎng)約為15456 nt，共編碼九種蛋白，包括核蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、大聚合酶(L)、融合蛋白(F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)、磷蛋白(P)以及非結(jié)構(gòu)蛋白C、D、V[4,14]。BPIV3 共有a、b、c 三種基因型,不同亞型間在基因結(jié)構(gòu)上并無(wú)明顯差別，只是在基因組全長(zhǎng)和部分氨基酸編碼區(qū)或非編碼區(qū)存在一定的差異。其中，基因a 型多數(shù)流行于北美，中國(guó)和日本也有該基因型的相關(guān)報(bào)道；基因b 型最早發(fā)現(xiàn)于澳大利亞，然后在阿根廷和美國(guó)也相繼分離到了基因b 型的病毒；基因c 型在2011 年首次分離于我國(guó)，隨后陸續(xù)擴(kuò)散到亞洲、美洲等部分國(guó)家；目前主要流行于我國(guó)的為a、c 基因型毒株[12,15]。

3 流行病學(xué)特點(diǎn)

BPIV3 能夠感染多種動(dòng)物，包括豬、牛、靈長(zhǎng)類以及多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等，也有感染人的報(bào)道[16-18]。牛副流感最主要的傳染源是病牛和帶毒牛，尤其是一些亞臨床感染的牛是最危險(xiǎn)的傳染源，往往能夠加重本病的流行。牛副流感可以通過(guò)直接接觸被感染動(dòng)物的分泌物進(jìn)行傳播，如鼻分泌物、眼分泌物等，也可以通過(guò)飛沫經(jīng)呼吸道進(jìn)行傳播，也有從公牛精液和母牛生殖道中分離到病毒的報(bào)道，因此牛副流感也存在垂直傳播的可能性[19]。牛副流感流行范圍很廣，一年四季均可發(fā)生，尤其是秋冬兩季最為頻繁，臨床上常與其他牛的呼吸道病原體發(fā)生混合感染而導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果[20]。

4 臨床表現(xiàn)和病理變化

牛感染BPIV3 后，潛伏期一般為2～5 d。有研究表明，在BPIV3 感染過(guò)程中，病毒囊膜表面的HN 蛋白會(huì)特異性結(jié)合于唾液酸氨基酸殘基并發(fā)生降解，導(dǎo)致病毒向靶細(xì)胞滲透，BPIV3 通過(guò)唾液酸受體侵入呼吸系統(tǒng)導(dǎo)致多種細(xì)胞發(fā)生感染。BPIV3感染牛呼吸系統(tǒng)能夠造成纖毛和非纖毛細(xì)胞大量死亡并導(dǎo)致肺部組織損傷，引起牛的支氣管炎和肺炎，導(dǎo)致感染肺葉發(fā)生實(shí)質(zhì)性病變，臨床上主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、流涕、流淚、發(fā)熱和呼吸加快等癥狀[13]。BPIV3 本身的致病能力并不強(qiáng)，但由于肺泡巨噬細(xì)胞也是BPIV3 的主要靶細(xì)胞之一，病毒感染巨噬細(xì)胞能夠?qū)е缕渫淌勺饔煤蜌⒕饔妹黠@降低，引起局部免疫抑制作用。因此，當(dāng)病毒感染引起的免疫抑制作用影響呼吸系統(tǒng)防御機(jī)制時(shí)，呼吸道條件致病性細(xì)菌如多殺性巴氏桿菌或溶血性曼氏桿菌等就可發(fā)生繼發(fā)感染，如果加上外界環(huán)境因素的改變?nèi)玳L(zhǎng)途運(yùn)輸中寒冷或酷熱、饑餓、擁擠等惡劣條件的共同作用下，受感染的病牛就可以產(chǎn)生非常嚴(yán)重的呼吸道癥狀，最終導(dǎo)致死亡[17]。

5 診斷方法

根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)以及病理變化特征可對(duì)本病做出初步診斷。但由于BPIV3 極容易和其他病原發(fā)生混合感染，在臨床上病牛的癥狀非常復(fù)雜，因此在進(jìn)行臨床綜合診斷的過(guò)程中要尤其注意。臨床綜合診斷的結(jié)果僅可作為初步參考，還需實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)一步確診?？梢圆杉∨：粑婪置谖锘蛘叻谓M織進(jìn)行病毒的分離鑒定，實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中一般采用牛腎細(xì)胞（MDBK 細(xì)胞）進(jìn)行BPIV3 的分離培養(yǎng)[21]。需要注意的是，在實(shí)際的操作過(guò)程中，常由于采集的病料運(yùn)輸或保存不當(dāng)而導(dǎo)致病毒分離失敗，從而錯(cuò)誤地判定為陰性結(jié)果。由于BPIV3 可以凝集雞和豚鼠等的紅細(xì)胞，因此可以采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)BPIV3 的抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)[22]。除此之外病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)等也是實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中比較常用的檢測(cè)方法。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR 方法被應(yīng)用到BPIV3 的檢測(cè)當(dāng)中來(lái)。常規(guī)的方法是參考已發(fā)表的毒株序列來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)比擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小和序列來(lái)判定所檢測(cè)樣品的類別。接著在此技術(shù)的基礎(chǔ)上，科研人員建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 的方法用于BPIV3 的快速、定量檢測(cè)[23]。未來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的診斷方法將會(huì)應(yīng)用到BPIV3 的檢測(cè)中來(lái)，這對(duì)于牛副流感的防治將會(huì)起到十分重要的作用。

6 防控措施

作為一種牛的急性、接觸性呼吸道傳染病，牛副流感的傳播速度快、傳播范圍廣，而且在臨床上BPIV3 往往能夠和其他病原發(fā)生混合感染，如BPIV3 感染后很容易繼發(fā)多殺性巴氏桿菌或溶血性曼氏桿菌等，造成嚴(yán)重的呼吸道癥狀最終導(dǎo)致死亡，一旦發(fā)生疫情應(yīng)立即采取隔離、封鎖等綜合性防疫措施。目前對(duì)于本病的治療尚無(wú)特效藥物。通常選用利巴韋林進(jìn)行抗病毒治療，用廣譜抗生素減輕細(xì)菌的繼發(fā)感染，同時(shí)輔以對(duì)癥治療，如退燒、補(bǔ)液、強(qiáng)心等[24]。平時(shí)良好的飼養(yǎng)管理，如堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、注意環(huán)境衛(wèi)生、采用合理的轉(zhuǎn)運(yùn)方式、減少應(yīng)激等有助于減少本病的發(fā)生。除此之外，疫苗的免疫接種是預(yù)防和控制本病的有效方法。早在剛剛分離得到BPIV3 不久，科研人員就開(kāi)始了BPIV3 疫苗的研制工作。最先研制成功的是滅活苗和弱毒苗，而且多數(shù)是數(shù)種病原的多聯(lián)疫苗，一般可通過(guò)肌肉注射或滴鼻進(jìn)行免疫。滅活苗與弱毒苗之間相比較而言，弱毒苗的優(yōu)點(diǎn)是免疫原性更好，免疫次數(shù)更少，缺點(diǎn)是弱毒苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)來(lái)說(shuō)滅活苗更為安全[25]。亞單位疫苗是繼滅活苗和弱毒苗之后研發(fā)的另一種疫苗，因?yàn)橹缓刑囟ǖ目乖瓫Q定簇，因此亞單位疫苗能夠精準(zhǔn)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，避免其他無(wú)關(guān)抗體的產(chǎn)生[26]。目前對(duì)于BPIV3 核酸疫苗的研究也日益增多，利用編碼BPIV3 某種保護(hù)性抗原的基因制備重組質(zhì)粒并注射到動(dòng)物體內(nèi)，從而使外源性基因在體內(nèi)表達(dá)并激活體液免疫和細(xì)胞免疫。核酸疫苗相對(duì)于前述的傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗更具保護(hù)力，但外源基因可能整合到宿主基因組的潛在威脅大大限制了基因疫苗的發(fā)展[27]。

國(guó)外對(duì)于BPIV3 疫苗的使用效果已經(jīng)在實(shí)踐中獲得了良好的反饋，臨床上接種BPIV3 疫苗可以顯著降低牛副流感的發(fā)病率和死亡率[28]。而在我國(guó)對(duì)BPIV3 疫苗的研發(fā)和使用還處于十分落后的狀態(tài)，大大影響了我國(guó)對(duì)牛副流感的防控效果。因此對(duì)于BPIV3 有效疫苗的研發(fā)和使用是急需解決的重要問(wèn)題，將對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展起到重要的作用。

7 展望

流行病學(xué)調(diào)查表明在我國(guó)的牛群中已經(jīng)廣泛存在BPIV3 感染的情況。作為牛呼吸道疾病綜合征的主要病原之一，在BPIV3 單獨(dú)感染的情況下造成的危害并不嚴(yán)重，但其易與其他病原發(fā)生混合感染而產(chǎn)生嚴(yán)重的呼吸道癥狀甚至引起死亡。目前對(duì)于牛副流感病毒致病機(jī)制的研究并不深入，除了僅具有提示意義的形態(tài)學(xué)觀察，目前尚無(wú)明確證據(jù)表明由BPIV3 感染引起相關(guān)病理性變化的具體機(jī)制，因此關(guān)于牛副流感病毒感染引起細(xì)胞損傷的分子機(jī)制的研究將會(huì)對(duì)未來(lái)本病的防治提供理論依據(jù)。現(xiàn)階段，我國(guó)對(duì)BPIV3 的研究還處于剛起步的階段，局限于基礎(chǔ)的病原學(xué)分離、檢測(cè)等。而在實(shí)際的牛副流感防控當(dāng)中，除了做好平時(shí)的飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生消毒外還應(yīng)具備安全可靠的商業(yè)化疫苗投入使用，而這也是我國(guó)現(xiàn)階段養(yǎng)牛業(yè)的短板。因此，對(duì)于安全、高效BPIV3 疫苗以及治療藥物的研發(fā)應(yīng)該是未來(lái)工作的重點(diǎn)。安全、高效的疫苗是預(yù)防BPIV3 的理想手段，而控制住BPIV3 也將對(duì)我國(guó)牛呼吸道疾病的防控產(chǎn)生十分重要的意義。