天然植物精油對生物膜的抑制作用及在食品行業(yè)的應用進展

◎ 王鳳婷，王金玲，李永勝，謝瑞龍

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

在社會經(jīng)濟發(fā)展的進程下，交通運輸、旅游業(yè)飛速發(fā)展，在人類頻繁交往的過程中增加了食源性致病微生物的傳播概率和范圍。隨著研究的深入，逐漸認識到大部分的細菌感染并不是由于游離狀態(tài)的細菌導致的，形成生物膜的病原微生物才是食物中毒的“罪魁禍首”[1]。生物膜是被多糖基質所包圍的一群細胞[2]，在分泌的多糖物質包裹下，細菌緊密黏附于有機或無機物質表面，避免外界因素作用從而離開附著物[3]。形成生物膜的細菌生理特性和形態(tài)與浮游菌相比存在明顯差異，生物膜表面的細菌與膜內(nèi)包裹的細菌也有著明顯的不同[4]。浮游菌與生物膜表面細菌易于從外界獲取營養(yǎng)，代謝迅速；生物膜內(nèi)部包裹的細菌則需要通過結構中的管道運輸營養(yǎng)、傳遞代謝物，代謝緩慢，因此結構內(nèi)部細菌對外界刺激不敏感，導致形成的生物膜具有高耐藥性。

食品生產(chǎn)行業(yè)常用的化學消毒劑，如含氯消毒液、季銨鹽清潔劑、漂白劑等均不能有效去除設備表面已形成的生物膜，黏附于不銹鋼表面的生物膜可耐受高濃度的氯[4]，并且殺菌時間也相對延長。生物膜結構可以影響熱傳遞的效率，使用高溫滅菌需要增加幾個小時的處理時間才能達到預期的效果，因此常用的物理方法也不能高效去除已形成的生物膜[5]。生物膜內(nèi)細菌難于被完全殺死，如果在食品加工過程中細菌生物膜由生產(chǎn)環(huán)境轉移至食品表面進一步繁殖，不但加速了食品的腐敗變質，也會增加食品安全風險[6]。常規(guī)的物理、化學殺菌方法存在著殺菌不徹底、影響食品食用安全、無法有效預防[7]等問題，因此對新型殺菌物質的探索是解決以上問題的重要舉措。

目前，主要的新型殺菌物質研究主要集中于抗菌肽[8]、有機酸[9-10]、天然植物精油[11]等，其中天然植物精油因其廣譜抗菌活性而被廣泛關注。精油是由具有抗菌特性的植物合成分泌的低分子量化合物形成的復雜混合物，一般來說，它們的抗菌活性與精油中存在的一些次生代謝產(chǎn)物與細菌細胞結構的相互作用有關。精油中的代謝產(chǎn)物主要包括萜類、苯丙類、醛類、酯類、醇類和酮類，其生物活性隨分子結構構型的差異而不同[12]。本文綜述了生物膜的形成以及植物精油對生物膜的抑制作用，以及天然植物精油用于應對生物膜所造成危害的控制措施。

1 生物膜

1.1 生物膜的特點

“生物膜”一詞在1978年被創(chuàng)造和使用，從那時起，生物膜相關微生物在基因轉錄方面與浮游的同種微生物有所不同就已經(jīng)得到充分的證明[13]。生物膜被定義為附著于生物或非生物體表面，由其產(chǎn)生的胞外多糖、蛋白質、DNA、RNA 等包裹形成的具有三維結構的微生物聚合體[14]。在目前的研究中“異質鑲嵌模型”和“蘑菇或郁金香模型”是兩種典型的生物膜結構，前者依靠胞外多糖將菌體聚合為多個疊狀體，再將疊狀體進一步聯(lián)結；后者在生物膜結構內(nèi)部形成可傳送營養(yǎng)及運輸廢物的管道[15]。

細菌可以在不同的物體表面上形成生物膜，如自然水域、土壤環(huán)境、活體組織、醫(yī)療設備、食品工業(yè)以及飲用水管道系統(tǒng)[6]，自然界中99%以上的細菌以生物膜形式存在[16]。在胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）包裹作用以及結構內(nèi)部代謝的作用下，生物膜可以保護微生物群落免受環(huán)境脅迫，這也是在自然和工業(yè)環(huán)境中生物膜的形成使細菌能夠對噬菌體、化學多樣性的生物殺菌劑、宿主免疫反應和抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因。

1.2 生物膜的形成

生物膜的形成受到細菌細胞特性、接觸面特性、pH 值、營養(yǎng)成分等多種因素的影響[17]，形成過程一般包括4 個階段。第一階段為細菌的黏附及定植，細菌通過鞭毛運動或沉降的方式聚集在一起[18]，與接觸表面在范德華力、疏水作用、靜電力等非特異性作用下附著在固體表面[19]，這時分泌的胞外聚合物較少，細菌集團可以重新分散為浮游菌，因此此階段的黏附是可逆的。第二階段為生長階段，聚集在一起的細菌數(shù)量逐漸增加，在分泌的表面蛋白[20]和胞外多糖的協(xié)助下更加緊密地附著于物體表面[21]，此階段細菌的黏附由可逆轉變?yōu)椴豢赡?。第三階段是生物膜的成熟階段，附著在表面后，細菌進一步適應生物膜中的生活，增加的胞外聚合物質創(chuàng)造了一個具有保護性的環(huán)境，使生物膜內(nèi)細菌對紫外光的抵抗力增加、基因交換率增加、生物降解能力改變以及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生增加[22]。第四個階段為生物膜內(nèi)細菌的釋放，固著在生物膜群落中的細菌要在新的區(qū)域定植必須有某種分散機制，生物膜碎片可能在流動中脫落或細菌通過從生物膜中釋放的方式重新成為浮游菌，生物膜碎片或釋放的浮游菌重新按照黏附及定植、生長、成熟、釋放的方式在新的表面形成生物膜[23]。

1.3 生物膜在食品行業(yè)的危害

病原微生物對食品的污染一直是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，也是造成全球巨大經(jīng)濟損失的一個原因。微生物生物膜含有破壞食品的成分和致病細菌，導致食品處理后的污染，降低了產(chǎn)品的質量和保質期，并且可能成為疾病傳播的一種方式[24]。在許多病原體中，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[25]和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[26]易于在材料和設備上形成生物膜，生物和非生物表面生物膜的形成是一種潛在的危害，導致病原體在食品生產(chǎn)和食品污染條件下的持續(xù)循環(huán)。因此，致病菌形成的生物膜在食品、食品加工等領域造成了嚴重的污染問題，直接影響到人類的健康和生活。一些研究表明，生物膜的污染會導致乳制品變質，耐熱芽孢桿菌產(chǎn)生的脂溶酶和蛋白水解酶，滅菌乳中存在或滅菌牛奶包裝過程中污染相應細菌的生物膜均會導致產(chǎn)品的腐敗，使無菌乳制品難以正常生產(chǎn)[27]。從衛(wèi)生角度來看，病原微生物附著在與食物接觸的表面可能導致潛在的衛(wèi)生問題，它可以在惡劣的條件下長期存在[24]。在食品生產(chǎn)設施中，具有保護性的胞外聚合物的生物膜很難去除，因此必須有適當?shù)姆椒▉眍A防、減少、控制和根除食品和加工表面的生物膜形成。

2 植物精油中化合物

精油是由植物器官，包括根、莖、葉、種子等合成分泌的具有抗菌性能的低分子量化合物的復雜混合物[28]，具有強大的抗菌性能。它們的特點是具有強烈的氣味，由芳香植物的次生代謝物形成，主要為萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物以及氮硫化合物[29]。起到抑制生物膜、抗菌作用的主要是萜類化合物、芳香族化合物和氮硫化合物。

萜類化合物是植物精油中含量最多的成分，又分為單萜、倍半萜、雙萜、三萜類化合物等，主要為醇、酮、烯類[30]。萜類化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，常見的如檸檬醛、薄荷醇、青蒿素[31]、檸檬烯[32]等。芳香族化合物是含量第二多的精油成分，其中對生物膜的抑制作用研究以帶有苯環(huán)的酚類化合物為主，如百里香酚[33]、香芹酚[34]、茶多酚[35]等。氮硫化合物在植物精油中雖含量較少，但具有較強氣味，主要存在于香辛料中，對微生物有較好的殺菌、抑制作用。如對大蒜素的研究中發(fā)現(xiàn)，大蒜素通過與ica 基因家族作用、抑制生物膜形成所需重要蛋白的合成進而實現(xiàn)了對S.aureus 生物膜形成的抑制作用[36]。

3 植物精油對生物膜的抑制原理

因植物精油的天然、廣譜抑菌和抗氧化特性[37]，近年來在食品中的應用受到了廣泛關注。有研究表明，用氫氧化鈉和精油配制的消毒溶液處理后的表面顯示出較強的抗生物膜作用，可以用于減少微生物在食品加工表面的定植[38]。

3.1 抑制群體感應

生物膜的形成是一個復雜的過程，它取決于遺傳和環(huán)境因素?；蛘{控的生物膜的形成是基于抑制群體感應（Quorum Sensing，QS），小的信號分子通過這種細胞間的通信系統(tǒng)在鄰近的細菌之間進行交換。得到廣泛認可的三種QS 分別為普遍存在于革蘭氏陰性菌中以?；呓z氨酸內(nèi)酯及其衍生物（N-acyl-Homoserine Lactones，AHLs）為自體誘導分子的LuxI/LuxR 型群體感應；革蘭氏陽性菌中以寡肽類分子AIP為自體誘導分子的三組分群體系統(tǒng)；以及革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌之間存在的種間信息交流信號分子[39]。植物在長期與環(huán)境中細菌抗爭過程中進化出抑制QS 的機制，植物精油中恰好含有這些對病原微生物QS 系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用的群體感應抑制劑[40]，可以有效抑制基于QS 產(chǎn)生的生物膜的形成、破壞已形成的生物膜的QS 系統(tǒng)。

天然群體感應抑制劑可以通過抑制自體誘導分子的產(chǎn)生、降解已形成的自體誘導分子、競爭性地與自體誘導分子靶位點結合的方式發(fā)揮作用[39]?，F(xiàn)有的研究中，植物精油在產(chǎn)生的群體感應抑制劑多是發(fā)揮抑制自體誘導分子產(chǎn)生的作用。亞抑菌濃度（sub-Minimum Inhibitory Concentration，sub-MIC）的薄荷精油可強烈干擾AHL 調節(jié)P.aeruginosa 和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的毒力因子和生物膜形成。對包含不同AHL 分子的各種革蘭氏陰性病原體的QS系統(tǒng)的干擾能力評估顯示，薄荷精油降低了AHL 依賴的紫色桿菌素的產(chǎn)生、毒力因子和生物膜的形成，表明其具有廣譜抗QS 活性[41]。

3.2 影響生物膜相關基因的表達

植物精油可以通過影響與生物膜形成相關的基因的表達來達到抑制生物膜生長的作用。對于有鞭毛的細菌，生物膜形成初期的菌體聚集就是通過鞭毛的運動來實現(xiàn)，在肉桂提取物對阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）生物膜合成的抑制機理研究中發(fā)現(xiàn)，肉桂精油中含有的肉桂醛能夠顯著性抑制鞭毛結構和生物合成基因fliD 和flhD 的表達，同時對影響QS 的基因luxR 表達產(chǎn)生抑制作用[42]。山蒼子精油作用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌后，可有效降低多糖細胞間黏附素的產(chǎn)生，從而降低S.aureus 間的黏附作用。深入研究后發(fā)現(xiàn)多糖細胞間黏附素的形成需要由icaA 基因控制，使用8 mg·mL-1的山蒼子精油能夠使icaA 基因的表達量下降45.2%[43]。通過對山茶油處理的金黃色葡萄球菌與對照組樣品進行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，山茶油處理后不僅多糖細胞間黏附素生成相關基因icaA 的表達量下降，其他生物膜形成相關基因，如sarA、cidA、hlA的表達量也會下降[44]。

3.3 破壞生物膜結構

天然植物精油不僅對生物膜的形成起抑制作用，對于已經(jīng)形成的生物膜也具有破壞作用。對于已形成的生物膜，因細菌之間以及外部由結構致密的胞外聚合物包裹，殺菌物質不易穿透聚合物作用于細菌，導致已經(jīng)形成的生物膜很難徹底去除，內(nèi)部細菌更是難于完全殺死。植物精油可以通過破壞生物膜結構使菌體暴露，從而達到殺菌效果。使用香芹酚和百里香酚處理后的陰溝腸桿菌C4（Enterobacter cloacae C4）生物膜，通過對胞外多糖的測定，發(fā)現(xiàn)其含量較未處理的生物膜顯著下降，通過激光共聚焦顯微鏡對處理后的生物膜進行觀察，發(fā)現(xiàn)結構明顯松散，生物膜整體結構中出現(xiàn)較多空洞，內(nèi)部活菌數(shù)量可見明顯減少[45]。

4 植物精油抑菌作用在食品行業(yè)的應用

植物精油多作為食品防腐劑[46]，應用于水果、蔬菜、水產(chǎn)、乳制品和肉制品等多種類食品的保鮮[47]。利用百里香和和牛至油復配于大豆蛋白可食膜中，可有效抑制牛肉中S.aureus、大腸桿菌（Escherichia coli）和單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的生長，并且適用于工業(yè)生產(chǎn)[48]。將牛至精油和迷迭香精油用于冷藏奶酪的保鮮中，可以在不影響乳酸菌發(fā)酵下有效抑制大腸桿菌的生長[49]。但研究表明，應用于食品加工時，精油的生物活性和殺菌效率往往會降低，需要的濃度可能比實驗中獲得的值高10 ～100 倍。這是由于食品中脂質成分、蛋白質和其他能夠與精油相互作用的化合物的存在，降低了精油中有效成分對微生物作用的效果。且精油的特性，如在水相中的溶解度和疏水性，也會影響精油在食品生產(chǎn)中應用時的抗菌效果。

因此，為了解決植物精油活性物質與其他物質發(fā)生反應、易于揮發(fā)、疏水性等問題，在應用時會采用包裹、構建微乳體系等方式提高其穩(wěn)定性。植物精油可以通過微膠囊技術進行包裹，使內(nèi)部精油緩慢釋放至周圍環(huán)境中。BAYRAK 等[50]的研究表明，在蛋黃醬中加入羅勒精油微膠囊，可以有效地抑制E.coli和沙門氏菌（Salmonella）的生長，在保證了蛋黃醬微生物安全性的同時，也提高了產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性、黏度和香氣?；蚴峭ㄟ^低能乳化、高壓均質、相變溫度法制備植物精油微乳液，增強精油溶解性和生物利用度[51]。乙醇作為表面活性劑的薄荷精油微乳體系對蘋果清汁中的E.coli有較好的抑制效果，該微乳體系可以通過破壞E.coli細胞膜通透性使其死亡[52]。

5 結語

生物膜的形成對食品工業(yè)會造成巨大的經(jīng)濟損失，生物膜會加速金屬的腐蝕，使設備備件的更換頻率增加；有些細菌還會分泌許多不同的蛋白水解酶和脂解酶，可以產(chǎn)生令人不快的氣味（酸味）和味道（苦味），對產(chǎn)品質量造成巨大影響。更重要的是生物膜的形成還會造成公共衛(wèi)生問題，導致食物中毒、胃腸炎或系統(tǒng)類疾病。精油作為天然抑菌劑易于獲取、毒性小，并具有良好的抗菌效果。但其作為生物膜抑制劑及清除劑在食品行業(yè)中的應用還較少，因此如何安全、高效，不破壞食品質量、風味地將天然植物精油應用于食品生產(chǎn)過程中是一個待深入研究的課題。