獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)的影響因素

王振偉

（乾元浩生物股份有限公司，江蘇 南京 210000）

在社會(huì)現(xiàn)代發(fā)展的新階段，獸用生物制品質(zhì)量不斷提升，很多企業(yè)在生產(chǎn)中重視獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)，利用現(xiàn)代化各種檢驗(yàn)手段，分析各種相關(guān)組織，獲得生物材料制備藥品，制定相應(yīng)的獸用疫苗，有效預(yù)防相應(yīng)疾病產(chǎn)生，也可以應(yīng)用在獸類病癥治療中。本文主要分析對(duì)獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)的影響因素，結(jié)合當(dāng)前的發(fā)展問題，探討有效的獸用生物制品中支原體污染的有效預(yù)防策略和目前常用的檢驗(yàn)方法，切實(shí)提升獸用生物制品支原體檢驗(yàn)的準(zhǔn)確率。

1 影響獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)的因素

1.1 原材料 對(duì)獸用生物制品中支原體的檢驗(yàn)需要按照相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和利用培養(yǎng)法進(jìn)行。獸用生物制品中支原體可以在無細(xì)胞培養(yǎng)基中逐漸生長，但其有一定的營養(yǎng)需求，而且條件比較苛刻。在對(duì)獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)時(shí)，利用培養(yǎng)法需要選擇綜合性培養(yǎng)基，我國專用的獸藥典指出，在對(duì)獸用生物制品進(jìn)行支原體檢驗(yàn)時(shí)，主要用兩種實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，即液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中包含多種營養(yǎng)物質(zhì)。而進(jìn)行支原體檢驗(yàn)的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)都是從動(dòng)物體內(nèi)提取的物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)因生產(chǎn)廠家的不同而有所差異，即使是同一廠家生產(chǎn)的，批次不同也會(huì)有所差異，所以在實(shí)際應(yīng)用前需要就廠家資質(zhì)進(jìn)行全面了解。培養(yǎng)基的敏感性還受相關(guān)物質(zhì)影響，特別要注意蛋白水解物的質(zhì)量。

由于獸用生物制品中支原體的檢驗(yàn)需要利用培養(yǎng)法，所以要選擇合適的培養(yǎng)基，加強(qiáng)對(duì)培養(yǎng)基原材料的嚴(yán)格把控，在檢驗(yàn)前提前做好各項(xiàng)測試，如培養(yǎng)基中需要各種試劑和附加成分，應(yīng)該選擇純度較高的。同時(shí)培養(yǎng)基中所用的各種培養(yǎng)液，必須按照要求進(jìn)行制備儲(chǔ)存，要重點(diǎn)防控避免中污染。

1.2 培養(yǎng)基制備量 在檢驗(yàn)獸用生物制品中支原體時(shí)，很多檢驗(yàn)人員會(huì)考慮成本問題，因此在利用培養(yǎng)法檢驗(yàn)過程中培養(yǎng)基制備量較少，此時(shí)很可能會(huì)導(dǎo)致獸用生物制品受到支原體污染。

如果在培養(yǎng)基中存在無機(jī)鹽類，則具有一定的緩沖作用，無機(jī)鹽類可以使培養(yǎng)基內(nèi)的液體滲透壓和pH 值得以維持，使支原體能在培養(yǎng)基中有效生存。但是如果培養(yǎng)基內(nèi)的液體較少，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)參數(shù)與支原體的需求存在差異，相關(guān)數(shù)值如果過高或過低都會(huì)導(dǎo)致支原體群體出現(xiàn)膨脹萎縮，此時(shí)會(huì)改變?cè)械闹гw代謝路徑，嚴(yán)重時(shí)會(huì)直接導(dǎo)致死亡。同時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的各種無機(jī)鹽在有一定的拮抗作用，需要保證無機(jī)鹽類各離子有合適的配比，才能使培養(yǎng)基內(nèi)支原體保持其生理平衡，維持生長檢驗(yàn)符合要求。除此之外培養(yǎng)基內(nèi)的氨基酸含量也會(huì)對(duì)支原體生長產(chǎn)生一定影響，氨基酸含量主要是影響支原體的代謝，如果添加量控制不好，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)緩沖作用達(dá)不到要求，氨基酸含量不足很容易出現(xiàn)支原體培養(yǎng)失敗。在實(shí)際操作制備培養(yǎng)基中，應(yīng)該按照要求，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)完成各項(xiàng)步驟，根據(jù)配方要求配備各種物品，控制好添加的順序，制備中把各物品進(jìn)行溶解后，然后按照要求混合。

1.3 培養(yǎng)基滅菌方法

1.3.1 液體培養(yǎng)基 利用液體培養(yǎng)基對(duì)獸用生物制品中支原體的檢驗(yàn)，需要考慮某些成分不能耐受加熱，所以對(duì)培養(yǎng)基中的血清等物質(zhì)進(jìn)行過濾除菌。

1.3.2 固體培養(yǎng)基 利用固體培養(yǎng)基則需要考慮到有些成分對(duì)加熱消毒有不同的耐受力，所以應(yīng)該根據(jù)各種成分的特性，選擇合適的方法進(jìn)行消毒除菌，并保證嚴(yán)格按照規(guī)范操作。制備固體培養(yǎng)基需要嚴(yán)格把控兩個(gè)步驟，（1）要對(duì)基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，此時(shí)主要考慮到固體的耐熱性比較好，通過設(shè)定好具體參數(shù)的高壓滅菌器進(jìn)行滅菌消毒，時(shí)間控制在20min 左右，后續(xù)在設(shè)備溫度有效降低后，及時(shí)打開設(shè)備蓋子取出培養(yǎng)基。（2）固體培養(yǎng)基制備中的其他成分，如果不耐熱，需要按照液體培養(yǎng)基的制備方法，通過過濾方式進(jìn)行除菌操作。

1.4 培養(yǎng)器皿及容器 檢驗(yàn)獸用生物制品中支原體時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基的要求非常高，為了達(dá)到合適的支原體培養(yǎng)要求，需要選擇合適的器皿和容器。如果利用玻璃器皿制備培養(yǎng)基，必須保證選用的玻璃容器是清潔無污染的，在制備培養(yǎng)基前需要放入高壓設(shè)備進(jìn)行滅菌，還要對(duì)器皿進(jìn)行干烤消毒。如果使用的器皿及容器則會(huì)導(dǎo)致支原體培養(yǎng)失敗。不能達(dá)到要求，因此需要重視培養(yǎng)器皿及容器的準(zhǔn)備，在應(yīng)用前特別重視對(duì)玻璃器皿或容器的洗滌，以保證符合檢驗(yàn)獸用生物制品中支原體的要求。清洗玻璃制品用的清洗劑可能會(huì)在內(nèi)表面或瓶蓋等部位存留，如果不重視，會(huì)影響培養(yǎng)基質(zhì)量。為了保證獸用生物制品中支原體培養(yǎng)和檢驗(yàn)順利進(jìn)行，應(yīng)該對(duì)檢驗(yàn)所用的各種培養(yǎng)器皿和容器的潔凈程度進(jìn)行檢測。很多廠家由于忽視培養(yǎng)基制備中的玻璃器皿及容器潔凈度問題，在后續(xù)開展相應(yīng)獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)時(shí)，檢驗(yàn)工作會(huì)受到很大的影響，導(dǎo)致檢驗(yàn)質(zhì)量不符合要求。目前很多廠家會(huì)利用玻璃器皿制作檢驗(yàn)獸用生物制品中支原體的培養(yǎng)基，如果使用塑料制品，可能在生產(chǎn)中會(huì)有一定的毒素殘留，而且不同的材質(zhì)是需要使用不同的生產(chǎn)工藝，培養(yǎng)基器皿表面的吸附能力也會(huì)有所差異，因此，應(yīng)該在培養(yǎng)器皿及容器各方面多加關(guān)注。

2 預(yù)防支原體污染獸用生物制品的有效策略

2.1 加強(qiáng)原材料的控制 在獸用生物制品生產(chǎn)中，會(huì)利用到細(xì)胞、血清等多種原材料，這些原材料都有利于支原體生存。獸用生物制品生產(chǎn)中的各種原材料會(huì)受到多種支原體污染，所以在獸用生物制品中，必須保持原材料處于無菌狀態(tài)，此時(shí)應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)原材料的污染控制，提前采取有效策略，有效阻止出現(xiàn)支原體污染。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，工作人員必須保持良好的個(gè)人衛(wèi)生狀態(tài)，在操作中嚴(yán)格按照要求，以有效避免獸用生物制品被支原體污染。要在發(fā)展中逐漸建立并完善其相應(yīng)管理制度，通過制度規(guī)范構(gòu)建完善的檢驗(yàn)體系，對(duì)各項(xiàng)細(xì)胞進(jìn)行多次的嚴(yán)格檢驗(yàn)，保證所有的細(xì)胞都是沒有支原體污染狀態(tài)。最后，在現(xiàn)代化發(fā)展中，需要引進(jìn)新型的細(xì)胞等，需要利用各種新設(shè)備進(jìn)行隔離培養(yǎng)，在生產(chǎn)制作前要進(jìn)行嚴(yán)格檢驗(yàn)，保證檢驗(yàn)符合質(zhì)量要求，才能進(jìn)入車間。

2.2 加強(qiáng)對(duì)獸用生物制品生產(chǎn)環(huán)境的控制 在生產(chǎn)車間內(nèi)必須要建立完善的管理制度，日常應(yīng)該按照計(jì)劃進(jìn)行清潔消毒，負(fù)責(zé)人員需要對(duì)內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行定期檢測，保證檢測各項(xiàng)數(shù)據(jù)在合格數(shù)值范圍內(nèi)。日常生產(chǎn)中必須對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行細(xì)化管理，加強(qiáng)生產(chǎn)中的設(shè)備、物品以及人員把控，明確具體的出入路線，避免各項(xiàng)在發(fā)展中出現(xiàn)交叉感染。如果對(duì)生產(chǎn)車間的設(shè)備進(jìn)行消毒必須要嚴(yán)格徹底，在對(duì)設(shè)備進(jìn)行消毒時(shí)需要參考相應(yīng)資料，并且提前了解生產(chǎn)設(shè)備使用特性，通常是通過高壓滅菌方式來消毒，適用時(shí)可以對(duì)一般設(shè)備進(jìn)行消毒水浸泡，必須使所有生產(chǎn)設(shè)備在投入生產(chǎn)前進(jìn)行徹底消毒。進(jìn)入生產(chǎn)環(huán)境內(nèi)的所有物品，需要提前做好表面消毒，或者是把相應(yīng)物品放置在紫外線燈罩區(qū)照射后，才可進(jìn)入生產(chǎn)車間。

2.3 加強(qiáng)對(duì)人員的管理 平時(shí)要規(guī)范對(duì)獸用生物制品中支原體檢測的生產(chǎn)流程，工作人員上崗前要提前進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，要求所有進(jìn)入生產(chǎn)車間的工作人員都必須更換符合要求的衣物，保證自身沒有裸露皮膚，如果相關(guān)人員存在呼吸道癥狀或有皮膚病必須嚴(yán)格禁止進(jìn)入，特別是不能讓其進(jìn)入的車間重點(diǎn)關(guān)注區(qū)域。同時(shí)，日常生產(chǎn)要求所有工作人員必須按照要求規(guī)范操作，保證個(gè)人操作的規(guī)范性，避免出現(xiàn)細(xì)節(jié)上的操作誤差。比如在手術(shù)臺(tái)操作中，如果手離開操作臺(tái)，需要使用器皿，需要及時(shí)對(duì)各項(xiàng)器械進(jìn)行消毒，否則很容易出現(xiàn)支原體污染問題。如果工作人員在操作臺(tái)操作中出現(xiàn)流汗問題用手擦，或相應(yīng)設(shè)備與人體裸露皮膚相接觸，都會(huì)導(dǎo)致支原體出現(xiàn)污染。

2.4 加強(qiáng)對(duì)消毒滅菌環(huán)節(jié)的管理 有效預(yù)防獸用生物制品的支原體污染，需要重視消毒滅菌環(huán)節(jié)，嚴(yán)格按照要求進(jìn)行消毒滅菌，避免各種生物制品出現(xiàn)污染物，減少微生物的滋生。在獸用生物制品生產(chǎn)過程中所用的各項(xiàng)器械和物品，都必須按照要求進(jìn)行消毒滅菌，在投入生產(chǎn)前，需要提前做好無菌測試，達(dá)到要求的才可使用，這樣可從源頭上控制支原體污染事件。此外，需要加強(qiáng)對(duì)消毒滅菌環(huán)節(jié)的重視，了解日常使用的消毒滅菌方式的有效性，如果在消毒滅菌中高壓鍋或相關(guān)設(shè)備堆積過多的物品，很容易出現(xiàn)加熱不均勻，導(dǎo)致消毒滅菌不徹底?；蛟谙緶缇性O(shè)定的循環(huán)時(shí)間比較短，特別是消毒滅菌的液體含量過高，此時(shí)可能存在一定的固體成分或膠狀物質(zhì)，在消毒滅菌中時(shí)間過短也會(huì)影響有效性。所以，在消毒滅菌環(huán)節(jié)必須提前就實(shí)際材料進(jìn)行詳細(xì)分析，記錄各方面參數(shù)，從多方面進(jìn)行把控，保證能夠達(dá)到理想效果。

2.5 合理使用抗生素，有效預(yù)防污染 根據(jù)相關(guān)研究可知，預(yù)防獸用生物制品的支原體污染可以通過抗生素發(fā)揮一定的抑制作用，所以在獸用生物制品生產(chǎn)過程中，可以合理使用抗生素來有效預(yù)防，避免出現(xiàn)支原體污染問題。但是很多支原體對(duì)抗生素的敏感性比較差，而且有些抗生素在使用中會(huì)存在一定的抗藥性，所以預(yù)防獸用生物制品的支原體污染時(shí)，需要選擇合適的抗生素種類，同時(shí)控制好抗生素的使用劑量，避免細(xì)胞等相關(guān)原材料的正常功能受到影響，同時(shí)能夠達(dá)到較好的污染預(yù)防效果。

3 常用的檢驗(yàn)獸用生物制品中支原體方法

3.1 一步法試劑盒 獸用生物制品支原體檢驗(yàn)方法在不斷推陳出新，目前多家公司在研究中研究出了一步法試劑盒，該法主要是通過專業(yè)擴(kuò)增等溫技術(shù)，使支原體得檢驗(yàn)操作非常簡單，選取很少的樣本量，就可以判定支原體檢測結(jié)果。根據(jù)曹媛媛等人的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室牛支原體檢驗(yàn)來看，結(jié)合利用多種方法進(jìn)行鑒定，每一種鑒定方法中都可以明確支原體物質(zhì)的存在，利用此些方法與培養(yǎng)法相比較，使用一步法可以快速了解檢驗(yàn)結(jié)果，檢測周期非常短。與PCR 檢驗(yàn)方法相比，一步法在操作中更為簡單快速，但是檢驗(yàn)結(jié)果存在一定的特異性問題，不能針對(duì)研究的支原體種屬進(jìn)行判別，根據(jù)此項(xiàng)研究可知，利用一步法試劑盒可以與其他檢測方法相結(jié)合，以此增強(qiáng)準(zhǔn)確性。

3.2 PCR 檢驗(yàn)方法 PCR 檢驗(yàn)方法相對(duì)來說檢測過程中靈敏性比較高，而且檢驗(yàn)的概率準(zhǔn)確性高，利用此種檢測方法，可以快速了解檢測結(jié)果，目前結(jié)合各項(xiàng)設(shè)備利用PCR 檢測方法，可以逐漸實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化發(fā)展，在檢測過程中并不需要標(biāo)本有過高的純度，因此該法在獸用生物制品中支原體檢驗(yàn)的優(yōu)勢非常明顯。但也存在一定的問題，即檢驗(yàn)結(jié)果存在假性狀態(tài)，需要根據(jù)獸用生物制品支原體各項(xiàng)條件進(jìn)行多次摸索，在研究中需要對(duì)各項(xiàng)操作熟悉。

3.3 分離培養(yǎng)法 此項(xiàng)檢驗(yàn)方法主要是通過培養(yǎng)基使支原體能夠出現(xiàn)典型菌落，具體應(yīng)用中檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確。但具體應(yīng)用中需要較長的時(shí)間，敏感性比較差。目前國家專用藥典中以此種方法作為專業(yè)檢測方法，還需要在未來發(fā)展中不斷探索新的檢驗(yàn)方法。

4 總 結(jié)

在獸用生物制品生產(chǎn)中相關(guān)企業(yè)應(yīng)該加強(qiáng)研究，探討有效的支原體檢測方法。支原體作為重要的病原微生物，如果出現(xiàn)感染會(huì)導(dǎo)致生物制品質(zhì)量明顯降低，基于獸用生物制品支原體污染的特性，應(yīng)該從多方面加強(qiáng)管制，保證獸用生物制品的質(zhì)量。分析具體的影響因素，在發(fā)展中按照國家新的通用標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)中對(duì)各個(gè)細(xì)節(jié)進(jìn)行規(guī)范，及時(shí)排除各種污染因素，促進(jìn)長遠(yuǎn)發(fā)展。