基于金納米顆粒過氧化物酶活性的比色傳感器在食品安全檢測中的應用

田冰，武煊，鐘玉潔，楊吉霞，陳應娟，陶曉奇,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市動物疫病預防控制中心，重慶，401120) 3(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶，400715)

食品在加工、運輸、貯存等過程中有可能帶入有害物質，如獸藥殘留、重金屬殘留、農藥殘留、致病菌等[1]，對食品質量安全造成威脅，因此有必要探索準確、高效、靈敏、經濟的檢測方法以保障消費者的食品安全。傳統(tǒng)的食品安全檢測方法如氣相色譜法[2]、高效液相色譜法[3]等雖然準確性高，但是步驟繁瑣、成本高、耗時長、需在實驗室進行，不能實現(xiàn)高效、現(xiàn)場檢測。近年來，隨著納米技術的發(fā)展，許多基于納米材料的智能傳感器在檢測中得到廣泛應用[4]。

金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)是指粒徑范圍在1～100 nm的超細金微粒，也被稱為金膠體(gold colloids)。由于具有獨特的局域表面等離子體共振特性和較高的摩爾消光系數(shù)，AuNPs表現(xiàn)出與尺寸相關的顏色變化。隨著AuNPs粒徑的增加，表面等離子共振譜帶從可見光區(qū)向近紅外區(qū)移動，溶液顏色反映出從紅色到藍色的變化[5]。

除了具有良好的光學性質，AuNPs還具有類似天然酶的活性，如過氧化物酶、過氧化氫酶、氧化酶和超氧化物歧化酶等[6]。由于AuNPs具有類似過氧化物酶的性質，因此在H2O2存在的情況下，AuNPs可以催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)[7]、ABTS[8]、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)[9]、Amplex Red(AR)[10]等底物發(fā)生顯色或熒光反應，從而利用底物顏色變化構建傳感器。此前AuNPs比色傳感器大多基于調控距離的聚集比色而構建，近年來基于AuNPs酶活性構建的比色傳感器應用越來越多，本文將重點討論基于AuNPs過氧化物酶活性構建的比色傳感器的傳感原理及其在食品安全檢測中的應用。

1 AuNPs的制備方法

AuNPs的經典合成方法是由TURKEVICH于1951年提出，然后由FRENS于1973年發(fā)展的Turkevich-Frens法[11]。將還原劑(如檸檬酸鈉、硼氫化鈉、抗壞血酸等)加入氯金酸溶液中，Au3+被還原成Au0，這種方法可合成粒徑10～50 nm的球形AuNPs，過程簡單，不需要高成本的專用設備。BRUST和SCHIFFRIN在1994年提出的Brust-Schiffrin法可以合成更小粒徑的AuNPs，在正十二烷基硫醇存在下，用硼氫化鈉在水-甲苯兩相中還原氯金酸，從而制得粒徑為1～8 nm內的熱穩(wěn)定AuNPs[12]。除了上述化學合成法外，還有晶種法[13]和生物合成法[14]等。

2 基于AuNPs過氧化物酶活性比色傳感器 的檢測原理

基于AuNPs的比色傳感器主要有兩種類型，一種依賴于AuNPs的表面等離子體共振特性，一種利用AuNPs能模擬天然酶發(fā)揮催化作用的性質。前者通過對AuNPs進行表面修飾，利用靶標和修飾基團之間的相互作用就可以調控AuNPs的分散狀態(tài)，呈現(xiàn)出不同的顏色，來實現(xiàn)對靶標的檢測[15]。不同的是，AuNPs酶活性比色傳感器的顏色變化來自底物的顯色反應，而不是AuNPs本身。與靶標的相互作用使AuNPs的酶活性發(fā)生變化，從而使反應底物呈現(xiàn)不同顏色，通過反應底物的顏色變化來檢測靶標。目前報道的AuNPs酶活性比色傳感器主要利用AuNPs的過氧化物酶性質，可分為以下兩類：靶標吸附-AuNPs傳感器、靶標-適配體-AuNPs傳感器。

2.1 靶標吸附-AuNPs傳感器的檢測原理

AuNPs具有類似過氧化物酶活性，能打開H2O2的O—O化學鍵形成羥自由基，催化無色底物(如TMB)氧化生成顯色產物(如藍色的oxTMB)，產物的顏色深淺與AuNPs酶活性正相關[15]。靶標吸附在AuNPs表面，改變AuNPs表面性質，從而調節(jié)AuNPs的酶活性。如卡那霉素[7]、三聚氰胺[16]、亞砷酸鹽[17]、Pb2+[18]、Hg2+[19-22]增強AuNPs的過氧化物酶活性，而多巴胺[23]、樂果農藥[9]則減弱AuNPs的過氧化物酶活性。通過肉眼觀察或儀器手段衡量顯色產物的顏色變化，即可對靶標進行定性或定量檢測。檢測原理如圖1所示。

圖1 靶標吸附-AuNPs傳感器的檢測原理Fig.1 Detection principle of the target-AuNPs sensors

2.2 靶標-適配體-AuNPs傳感器的檢測原理

適配體(aptamer)是一段單鏈DNA或RNA，可以與核酸、蛋白質、金屬離子和小分子發(fā)生特異性結合[24]，具有親和力高、體積小、易于合成和修飾等優(yōu)點。ELLINGTON等[25]首次報道使用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術，從隨機單鏈核酸序列庫中分離合適的結合序列，然后進行PCR擴增，可以得到與靶標高度特異性親和的適配體。單鏈DNA通過堿基的配位作用吸附到AuNPs表面[26]，影響AuNPs酶活性，從而構建適配體-AuNPs比色傳感器。靶標通過與適配體的結合，間接調控AuNPs的過氧化物酶活性，實現(xiàn)比色檢測。靶標對AuNPs過氧化物酶活性的調控表現(xiàn)為增強或抑制，關于其機理，有以下兩種解釋。

一種解釋認為，適配體屏蔽了AuNPs表面的活性位點，使AuNPs酶活性被抑制。加入靶標后，由于適配體與靶標的高親和力、特異性結合，導致適配體結構變化并從AuNPs表面解吸附，AuNPs活性位點重新暴露，從而恢復酶活性(圖2-a)[27-31]。

另一種解釋認為， DNA通過堿基吸附在AuNPs上，其帶負電荷的磷酸骨架暴露在AuNPs表面，使DNA-AuNPs復合物的負電荷密度增加，與帶負電荷的底物(如ABTS)相互作用減弱，表現(xiàn)為酶活性降低,與帶正電荷的底物(如TMB)作用力更強，表現(xiàn)出明顯的酶活性增強。當靶標存在時，靶標-適配體的結合使適配體從AuNPs上解吸附，AuNPs表面負電荷減少，相應地導致AuNPs的酶活性增強(負電荷底物)(圖2-b)或減弱(正電荷底物)(圖2-c)[8, 32-35]。

a- AuNPs酶活性增強;b-AuNPs酶活性增強;c- AuNPs酶活性減弱圖2 靶標-適配體-AuNPs傳感器的檢測原理Fig.2 Detection principle of the target-aptamer-AuNPs sensors

3 基于AuNPs過氧化物酶活性的比色傳感 器在食品安全檢測中的應用

獸藥、農藥的殘留，以及重金屬、致病菌和其他非法添加成分是導致食品安全問題的主要來源，危害人類健康?；贏uNPs過氧化物酶活性構建的比色傳感器已被應用于各類食品樣品的安全檢測，如表1所示。

表1 基于AuNPs過氧化物酶活性比色傳感器的應用Table 1 Application of colorimetric sensor based on AuNPs peroxidase activity

3.1 食品中獸藥殘留的檢測

可食用動物加工成食品后，在養(yǎng)殖過程中使用的獸藥有可能會有殘留，如抗生素、抗菌劑等。SHARMA等[27]利用AuNPs類過氧化物酶活性和Ky2適配體構建“turn-off/turn-on”傳感器，實現(xiàn)了卡那霉素的高靈敏快速檢測，檢測限1.49 nmol/L，時間3～8 min，比傳統(tǒng)的鹽誘導AuNPs聚集方法靈敏15倍，速度快20倍。WANG等[7]發(fā)現(xiàn)卡那霉素通過—NH2吸附在檸檬酸鹽封端的AuNPs上，改變AuNPs表面性質，從而增強AuNPs的過氧化物酶活性；基于此原理，開發(fā)了基于AuNPs過氧化物酶活性變化直接檢測卡那霉素的方法，方法簡便，不需要對AuNPs進行任何修飾，在奶、肉中檢測限低至0.1 nmol/L。ZHAO等[8]以ABTS為顯色底物構建AuNPs-適配體傳感器檢測牛奶中的鏈霉素，線性范圍0.1～0.5 μmol/L，檢測限86 nmol/L。類似地，SONG等[36]發(fā)現(xiàn)帶負電的諾氟沙星通過靜電相互作用吸附在帶正電荷的1-Me-D-Trp@AuNCs(1-甲基-D-色氨酸修飾的納米金簇)表面，提高1-Me-D-Trp@AuNCs的酶活性，無需適配體即可直接檢測諾氟沙星，檢測限0.2 μmol/L。ZHANG等[33]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素的特異性適配體增強AuNPs酶活性，而加入四環(huán)素時，AuNPs酶活性降低，以此實現(xiàn)原料奶中四環(huán)素的高靈敏度檢測，該方法檢測限為46 nmol/L。

3.2 食品中重金屬的檢測

環(huán)境中的重金屬元素可能通過食物鏈轉移至人體，危害人類身體健康。LIAO等[18]利用Pb2+誘導AuNPs聚集，增強其過氧化物酶活性的原理，建立了一種簡單可靠的比色方法，用于檢測水中的Pb2+含量。LONG等[19]發(fā)現(xiàn)Hg2+可被AuNPs表面的檸檬酸鈉還原為Hg0，Hg0分散在AuNPs表面，改變表面性質，提高AuNPs的過氧化物酶活性，從而無標記檢測Hg2+。HAN等[20]的研究證實了LONG的觀點，并且制成了AuNP比色試紙條，能同時執(zhí)行多個樣品檢測，簡單便攜，可應用于現(xiàn)場檢測。AN等[21]在LONG的比色傳感體系的基礎上，使用溫度計作為信號讀取器，當加入Hg2+時，AuNP@β-CD(β-環(huán)糊精修飾的納米金)的催化活性顯著提高，藍色oxTMB的形成增強，從而導致溫度升高，可以在10 min內快速檢測，檢測限0.06 μmol/L。JIANG等[22]用生物相容性更高的殼聚糖納米金(CS-AuNPs)檢測水中的Hg2+，檢測限為0.04 μmol/L。

3.3 食品中農藥殘留的檢測

蔬菜、水果、谷物等農作物表面易殘留種植過程中施用的農藥。HU等[9]發(fā)現(xiàn)樂果農藥的分子結構中含有酰胺鍵，可能起著與巰基相似的作用，能螯合Au+來抑制AuNPs的酶活性，因此可用AuNPs檢測黃瓜、西紅柿、卷心菜等農產品中的樂果農藥，檢測限為4.7 μg/L。WEERATHUNGE等[29]和 YANG等[34]利用啶蟲脒與適配體結合從而恢復AuNPs酶活性，分別以TMB和ABTS為顯色底物，開發(fā)了檢測啶蟲脒的適配體-AuNPs傳感器，各自的檢測限分別為120、1.02 μg/L。

3.4 食品中致病菌的檢測

食源性致病菌直接或間接污染食品及水源，是導致食品安全問題的重要來源。DAS等[30]利用銅綠假單胞菌與其適配體的結合恢復AuNPs的酶活性構建傳感器，可以在10 min內完成快速檢測，檢測限為60 CFU/mL。CHEN等[37]也基于此原理建立了鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，在雞蛋樣品中檢測限低至1 CFU/mL。YAO等[38]選擇金黃色葡萄球菌免疫球蛋白Y作為適配體，適配體修飾抑制了AuNPs催化活性，金黃色葡萄球菌的結合恢復AuNPs酶活性，催化TMB底物顯色。該方法對復雜食品基質中金黃色葡萄球菌的定量檢測具有很強的抗干擾能力，在豬肉、牛奶中檢測限為10 CFU/mL，但檢測時間較長，需要65 min。陳威風等[39]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的適配體增強AuNPs酶活性，單增李斯特菌與適配體特異性結合使AuNPs酶活性降低，從而檢測豬肉中的單增李斯特菌，檢出限約為5 CFU/mL。

3.5 食品中其他非法成分的檢測

NI等[16]利用三聚氰胺使AuNPs過氧化物酶活性增強的原理簡便快速地檢測原料奶和奶粉中的三聚氰胺，檢測限為0.2 nmol/L?；谙嗨频脑恚琗UE等[17]建立了亞砷酸鹽的檢測方法，檢測限為0.01 mg/L。SUN等[31]報道了一種基于適配體的比色檢測法玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)，適配體抑制AuNPs酶活性，在ZEN存在的情況下，適配體與ZEN結合，不再抑制AuNPs酶活性，此方法可在15 min內快速響應，檢測限為10 ng/mL。而HU等[35]報道的相思子毒素(abrin)檢測原理則剛好相反，abrin的適配體活化AuNPs表面提高酶活性，abrin結合導致適配體從AuNPs表面脫附，導致酶活性降低。ZHAO等[40]用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)修飾AuNPs，適配體抑制CATB-AuNPs的酶活性，加入孔雀石綠后，酶活性恢復，此方法檢測限低至1.8 nmol/L。

4 存在的問題與展望

4.1 存在的問題

不難發(fā)現(xiàn)，目前基于酶活性的適配體-AuNPs比色傳感器的核心原理是靶標結合適配體使其從AuNPs上解吸附，從而調控酶活性。這種解釋基于一個假設前提：靶標與適配體結合的親和力遠大于適配體與AuNPs的結合力，只考慮到靶標與適配體的結合，而忽略了靶標與AuNPs之間潛在的相互作用。最近的一些研究表明，靶標僅能解吸下來極少的預先吸附的適配體(解吸率<5%)[41]，也就是說幾乎不可能通過靶標-適配體結合從AuNPs表面解吸適配體；同時，靶標可以吸附在AuNPs上，并且抑制適配體的吸附[42-46]。因此AuNPs酶活性的調控可能不依賴于靶標-適配體的結合，而是取決于靶標與AuNPs的吸附。如前文所述，SHARMA等[27]用適配體-AuNPs檢測卡那霉素，認為卡那霉素通過特異性結合使適配體解吸，從而增強AuNPs酶活性。但根據(jù)ZHOU等[47]的報道，卡那霉素很難使適配體從AuNPs表面解吸(卡那霉素濃度為10 μmol/L時，適配體幾乎沒有解吸，濃度高達0.1 mmol/L時只有12%適配體解吸，而濃度再升高并沒有引起更多的適配體解吸)；同時，WANG等[7]發(fā)現(xiàn)卡那霉素通過靜電吸引和氨基-羧基相互作用強吸附在檸檬酸鹽包被的AuNPs表面。因此AuNPs酶活性的增強很可能歸功于卡那霉素在AuNPs上的吸附，而不是適配體從AuNPs表面解吸[48]。

因此我們在討論靶標-適配體-AuNPs比色傳感的原理時，務必要考慮AuNPs對靶標的吸附情況。對于AuNPs弱吸附的靶標，如K+，可以用靶標-適配體結合使適配體從AuNPs解吸，從而調控AuNPs酶活性來解釋[46]。但對于強吸附的靶標，如卡那霉素[27]、氯霉素[42]、亞砷酸鹽[44]、ATP[45]、多巴胺[46]等，這種原理解釋只有部分正確。為了更嚴謹?shù)亟忉專梢砸胍欢芜m配體的非結合突變序列作為對照[42]，或者對AuNPs進行表面修飾使其對靶標的吸附力減小[49]。

4.2 展望

基于AuNPs過氧化物酶活性構建的比色傳感器已經在應用方面取得了很多優(yōu)秀的成果，但仍然面臨一些亟待解決的問題，如下：

(1)吸附在AuNPs上的靶標分子如何調節(jié)AuNPs的酶活性，還有待系統(tǒng)地研究。

(2)提高AuNPs在中性條件下的酶活性。AuNPs的最佳催化活性一般發(fā)生在強酸性條件下(pH值在3～4左右)，中性條件下的過氧化物酶活性可以忽略不計[50]。這一缺點導致AuNPs無法應用于某些需要中性pH條件的靶標(如蛋白質)，因為蛋白質在強酸性環(huán)境中會發(fā)生構象變化，可能導致檢測的準確性和靈敏度變差。

(3)基于AuNPs酶活性構建的比色傳感器，絕大多數(shù)利用的是AuNPs過氧化物酶性質，其他酶性質的利用還有待開發(fā)，期待未來創(chuàng)造更多的響應信號類型。