細毛石花菜多糖自由基清除能力和理化性質的研究

裴育，楊勝濤，馮瑞，周春霞,2，洪鵬志,2*

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東 湛江，524088) 2(南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江，524025)

石花菜是一種海藻，是提取瓊脂的重要原料，并廣泛分布于亞洲國家。石花菜具有多種生物學活性，包括增強免疫活性，改善脂質代謝和預防飲食引起的肥胖癥[1]。細毛石花菜(Gelidiumcrinale.)又名馬毛(山東)、狗毛菜(廣東)、巖衣(浙江)，也是一種石花菜科石花菜屬的海洋經(jīng)濟紅藻，是一種傳統(tǒng)的食用藻類，很可能表現(xiàn)出與石花菜相似的生物學活性,目前，僅見少數(shù)有關細毛石花菜的研究。多糖是石花菜中含量最多的生物活性組分，且以半乳聚糖含量最高、研究最廣[2]。近年來從海藻中分離出的多糖引起了越來越多的關注。海藻中的硫酸多糖具有抗氧化，抗炎和其他藥理活性[3-4]，可用于營養(yǎng)保健，制藥和化妝品行業(yè)。目前，尚不清楚來自細毛石花菜的多糖是否能表現(xiàn)出抗氧化活性。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是通過正常的代謝活動產(chǎn)生的。當ROS過量時，與蛋白質、脂質和核酸發(fā)生反應，破壞氧化還原平衡[5]。在生物系統(tǒng)中，ROS的形成和清除能力之間的平衡是至關重要的，這種平衡向ROS形成的轉變被稱為氧化應激[6]。ROS過量會導致衰老，增加患各種人類疾病的風險，如心血管[7]、糖尿病[8]、和癌癥[9]等。因此，嚴格控制ROS水平顯然對生物系統(tǒng)至關重要。目前，合成抗氧化劑能夠有效地幫助人體減少氧化損傷，然而產(chǎn)生的副作用可能導致肝損傷和其他疾病。因此，利用和開發(fā)天然抗氧化劑是必要的，因為它們可以幫助人體消除過量產(chǎn)生的ROS[10]。近年來，從海洋動植物、細菌、真菌和高等植物等天然來源開發(fā)抗氧化劑在食品工業(yè)和預防醫(yī)學領域引起了極大的興趣。其中，海藻是生物活性物質最豐富的來源之一，海藻衍生產(chǎn)品的應用日益廣泛。近幾十年來，大量的研究表明，海藻中的硫酸多糖在體外可作為自由基清除劑、預防生物體氧化損傷的抗氧化劑以及腫瘤細胞的生長抑制劑[11-12]。因此，硫酸多糖具有有效的抗氧化活性。

本研究從細毛石花菜中分離出硫酸化多糖，并對其理化性質進行分析。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的RAW264.7細胞中評估了來自細毛石花菜的硫酸多糖的抗氧化作用，本研究為細毛石花菜多糖的研究和開發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮細毛石花菜采集于廣東省湛江市硇洲島；小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞，蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司；高糖培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素(雙抗)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，美國Gibco公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、LPS，美國Sigma公司；菲洛嗪、氯化亞鐵，上海麥克林生化科技有限公司；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescent yellow diacetate，DCFH-DA)熒光探針，上海碧云天生物技術有限公司。

BC-J8二氧化碳培養(yǎng)箱，松下健康醫(yī)療器械株式會社；N-4000旋轉蒸發(fā)，東京理化器械株式會社；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥儀，德國Christ公司；Epoch酶標儀，Bioteck儀器公司；IX73倒置熒光顯微鏡，日本東京奧林巴斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取

多糖提取工藝流程如圖1所示，稱取500 g硇洲細毛石花菜，洗凈、干燥、粉碎，以料液比1∶8(g∶mL)加入90%(體積分數(shù))乙醇浸泡4 h，收集濾渣，干燥至恒重，以料液比1∶8(g∶mL)加入0.1 mol/L的HCl浸泡8 h，中和溶液后離心收集上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮，加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉24 h，離心收集沉淀，透析48 h，冷凍干燥，即獲得細毛石花菜多糖，備用。

圖1 多糖提取流程圖Fig.1 Flow chart of polysaccharide extraction

1.2.2 細毛石花菜多糖化學組成分析

采用苯酚-硫酸比色法[13]測定細毛石花菜多糖的總糖含量；采用BCA(bicinchoninic acid)法[9]測定蛋白濃度；采用明膠比濁法[13]測定硫酸基團含量；采用3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)[14]法測定還原糖。

1.2.3 細毛石花菜多糖單糖組成分析

細毛石花菜多糖的單糖組成通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生結合HPLC的方法測定[15]。首先，將樣品多糖(10 mg)通過三氟乙酸溶液在110 ℃下水解6 h，然后冷卻至環(huán)境溫度。然后，加入甲醇(1 mL)，用氮氣干燥并再重復3～4次以除去過量的三氟乙酸。通過將0.3 mol/L NaOH溶液溶解在10 mL 恒定體積中獲得多糖水解物。另外，通過使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮作為衍生劑對標準單糖和樣品單糖進行衍生。將混合標準單糖溶液和樣品多糖水解產(chǎn)物與等體積的NaOH(0.6 mol/L)溶液混合。將化合物與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮混合后，反應在70 ℃下進行2 h。加入HCl將pH調至7，并加入水將溶液體積稀釋至1 mL。加入氯仿，以4 000 r/min離心10 min，棄去有機溶液，重復萃取3次，并以恒定體積將水添加至2 mL。樣品和標準物質首先通過0.45 μm的微孔過濾器，然后進行HPLC分析。最后，通過配備有帶有30 ℃柱溫檢測器的UV檢測器的Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)的HPLC儀器進一步檢測混合物。在等度洗脫條件下，流動相為磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)與乙腈按一定體積比(80∶20)混合。

1.2.4 細毛石花菜多糖分子質量測定

細毛石花菜多糖的分子質量通過凝膠滲透色譜系統(tǒng)(gel permeation chromatography，GPC)測量，該系統(tǒng)配備了Waters 515折射率檢測器和Shodex SBOHPAK-806-803色譜柱。500 μL樣品被注入，流速設定為1 mL/min。分子質量對數(shù)和時間分別用作縱坐標和橫坐標。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，獲得了重均分子質量(Mw)，數(shù)均分子質量(Mn)和多分散性(Mw/Mn)的信息。

1.2.5 紅外光譜測定細毛石花菜多糖組分

參照JIA等[16]的方法，先將溴化鉀用瑪瑙研缽研磨，再過孔徑為0.147 mm的網(wǎng)篩，并在紅外燈下干燥4 h，以溴化鉀壓成半透明薄片做空白，以樣品與溴化鉀混合制成壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行掃描。

1.2.6 體外抗氧化活性

1.2.6.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考WANG等[17]所描述的方法稍作改動。將過硫酸鉀儲備液(2.45 mmol/L)與ABTS儲備液(7 mmol/L)按體積比1∶1制備ABTS陽離子自由基儲備溶液，并在黑暗中室溫保持16 h。ABTS陽離子自由基儲備溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖鹽水(pH = 7.4)稀釋，在734 nm處的吸光度為0.700±0.020。將0.5 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL)與2.5 mL ABTS陽離子自由基溶液混合并在室溫下反應30 min，在734 nm處測量吸光值。多糖的ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為0.5 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+2.5 mL ABTS陽離子自由基溶液；A2為0.5 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液；A0為0.5 mL 超純水+2.5 mL ABTS陽離子自由基溶液。

1.2.6.2 Fe2+螯合能力測定

根據(jù)AGRAWAL等[18]所描述的方法進行一些改動。將1 mL不同質量濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL)的細毛石花菜多糖與0.1 mL FeCl2(2 mmol/L)及0.2 mL菲洛嗪(5 mmol/L)混合，充分搖勻，在室溫下靜置15 min，并在562 nm處測定混合物的吸光度。Fe2+螯合能力計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為1 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪；A2為1 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+0.3 mL超純水；A0為1 mL超純水+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪

1.2.6.3 DPPH自由基清除能力測定

參考JIA等[11]的方法測定并稍作修改。將2 mL不同質量濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL)的細毛石花菜多糖與4 mL DPPH-甲醇(0.05 mg/mL)溶液混合，在室溫下避光反應30 min。在517 nm處測量吸光值。細毛石花菜多糖對DPPH自由基清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A1為2 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+4 mL DPPH；A2為2 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+4 mL甲醇；A0為2 mL超純水+4 mL DPPH

1.2.6.4 羥自由基清除能力測定

根據(jù)WANG等[17]所描述的方法并稍作改動。分別加入2 mL H2O2(9 mmol/L)，F(xiàn)eSO4(9 mmol/L)和不同質量濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL)的細毛石花菜多糖到15 mL比色管中。然后使混合溶液在25 ℃下反應10 min。然后，將2 mL的水楊酸(9 mmol/L)加入到混合物中，反應30 min，測量510 nm處吸光值。羥自由基清除率計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A1為2 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸；A2為2 mL不同質量濃度的細毛石花菜多糖+6 mL超純水；A0為2 mL超純水+2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸

1.2.7 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞培養(yǎng)在的DMEM培養(yǎng)基中(含10%FBS和1%雙抗,體積分數(shù))，放置在溫度為37 ℃的CO2(5%，體積分數(shù))培養(yǎng)箱中。

1.2.8 細毛石花菜多糖對RAW264.7細胞存活的影響

將RAW264.7細胞以5×103個/孔的濃度接種到96孔板中，每孔100 μL，然后再孵育24 h，然后將不同質量濃度(10、50、100、200 μg/mL)的100 μL的細毛石花菜多糖加入孔中孵育24 h。之后每孔加入100 μL(0.5 mg/mL)MTT，孵育4 h。棄掉上清液，并加入100 μL二甲基亞砜，使細胞中的沉淀充分溶解。用酶標儀在540 nm下測定混合物的吸光值。

1.2.9 ROS含量的測定

使用熒光探針DCFH-DA測量細胞內ROS的產(chǎn)生。將RAW264.7細胞以3×104個/孔的濃度接種到24孔板中，并用然后將不同質量濃度(10、50、100、200 μg/mL)的100 μL的細毛石花菜多糖加入孔中孵育2 h，再加入10 μL(1 μg/mL)的LPS孵育24 h。隨后用滅菌的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌3次。每孔加入500 μL(10 μmol/L)DCFH-DA后，避光孵育30 min，用熒光倒置顯微鏡拍照[19]。

DCFH-DA測量細胞內ROS水平。Hoechst 33342是一種用于對DNA進行染色的熒光染料，用于測量每個孔中剩余的RAW264.7細胞數(shù)量。將濃度為10 mol/L的DCF加入到96孔板。孵育25 min后用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞。然后加入質量濃度為5 μg/mL的Hoechst 33342孵育15 min。使用熒光酶標儀測定Hoechst 33342和DCFH-DA的熒光值。Hoechst 33342的激發(fā)長和發(fā)射波長分別為350 nm和460 nm，DCF的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485 nm和530 nm[20]。

1.2.10 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平測定

RAW264.7細胞以5×106個/孔的濃度接種到6孔板中孵育24 h。吸棄舊培養(yǎng)基，然后將不同質量濃度(10、50、100、200 μg/mL)的100 μL的細毛石花菜多糖加入孔中孵育2 h，再加入10 μL(1 μg/mL)的LPS孵育24 h。吸棄舊培養(yǎng)基，用滅菌的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并加入70 μL裂解緩沖液，在冰上裂解30 min。測定蛋白含量，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉移膜處理，將目標蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。然后用脫脂牛奶(質量分數(shù)為5%)封閉2 h，用一抗(稀釋比例為1∶500)在4 ℃下孵育過夜。在室溫下用二抗(稀釋比例為1∶2 000)孵育2 h，然后用緩沖液洗滌3次，最后利用顯色觀察并拍照記錄[21]。

1.2.11 統(tǒng)計學分析

每組實驗重復3次，結果采用X±SD表示。采用Origin 2021、Image J和Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析及制圖。顯著性差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)和t-test分析。

2 結果與分析

2.1 細毛石花菜多糖的化學組分

經(jīng)測定細毛石花菜多糖中總糖占比為70.51%，蛋白質占比為5.27%，還原糖占比為8.42%，硫酸基團占比為16.50%。并對細毛石花菜多糖的單糖組成進行分析，結果如表1所示，細毛石花菜多糖主要是由核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成。其中半乳糖含量最高，巖藻糖和木糖次之。半乳糖所占的比例超過了所有單糖的一半，含量最少的是阿拉伯多糖。并且經(jīng)GPC定細毛石花菜多糖的相對分子質量為25.80 kDa。

表1 細毛石花菜多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of polysaccharide from Gelidium crinale

2.2 細毛石花菜多糖的結構表征

圖2 細毛石花菜多糖的FT-IR光譜Fig.2 FT-IR spectra of polysaccharide from Gelidium crinale

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS還經(jīng)常用于測量食品和藥品中天然化學物質的抗氧化能力。細毛石花菜多糖的ABTS陽離子自由基清除能力如圖3所示。細毛石花菜多糖表現(xiàn)出良好的ABTS陽離子自由基清除活性，并且還觀察到濃度依賴性自由基清除作用。當多糖質量濃度從0.2 mg/mL 增加到8 mg/mL時，細毛石花菜多糖的清除率從3.85%增加到89.10%，計算出ABTS陽離子自由基清除能力的IC50為2.215 mg/mL。在ABTS陽離子自由基系統(tǒng)中表現(xiàn)出出色的抗氧化活性。

圖3 細毛石花菜多糖對ABTS陽離子自由基清除率的影響Fig.3 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on the scavenging rate of ABTS free radicals

2.3.2 Fe2+螯合能力測定

鐵是人體中重要的過度金屬元素，通過Fe2+和Fe3+之間的轉換直接參與人體內電子的傳遞過程以及氧化還原反應。細毛石花菜多糖的亞鐵離子螯合能力評價見圖4，細毛石花菜多糖表現(xiàn)出良好的亞鐵離子螯合能力，并且還觀察到濃度依賴性自由基清除作用。當多糖質量濃度從0.2 mg/mL增加到8 mg/mL時，細毛石花菜多糖的清除率從0.21%增加到76.81%，計算出Fe2+螯合能力的IC50為2.688 mg/mL,表現(xiàn)出出色的抗氧化活性。

圖4 細毛石花菜多糖對Fe2+螯合能力的影響Fig.4 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on Fe2+ chelating ability

2.3.3 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基能夠接受自由基，成為穩(wěn)定的抗磁性分子。因此，DPPH被廣泛用于測試各種化合物的自由基清除能力。細毛石花菜多糖的DPPH自由基清除能力如圖5所示。當多糖質量濃度從0.2 mg/mL增加到8 mg/mL時，DPPH自由基清除率從3.02%增加到56.11%，計算出DPPH自由基清除能力的IC50為7.408 mg/mL。結果表明，細毛石花菜多糖表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

圖5 細毛石花菜多糖對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on the scavenging rate of DPPH free radical

2.3.4 羥自由基清除能力測定

羥自由基非?；顫姡⑶以隗w內的壽命短，同時對有機體有害。因此，除去羥自由基對于抗氧化劑在細胞或食物系統(tǒng)中的防御至關重要。細毛石花菜多糖的羥自由基清除能力如圖6所示。當多糖質量濃度從0.2 mg/mL增加到12 mg/mL時，羥自由基清除率分別從11.09%增加到50.43%，計算出羥自由基清除能力的IC50為13.56 mg/mL。結果表明，細毛石花菜多糖表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

圖6 細毛石花菜多糖對羥自由基清除率的影響Fig.6 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on the scavenging rate of hydroxyl free radical

2.4 細胞活力測定

由圖7可以看出，與不加細毛石花菜多糖的空白組相比，加入細毛石花菜多糖(10、50、100、200 μg/mL)的實驗組細胞存活率無明顯變化。說明細毛石花菜多糖對RAW264.7細胞無毒性作用，可選擇該質量濃度的細毛石花菜多糖做后續(xù)實驗。

圖7 細毛石花菜多糖對RAW264.7細胞活力的影響Fig.7 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on the viability of RAW264.7 cells

2.5 細毛石花菜多糖對ROS的清除

氧化是許多生物體生產(chǎn)能量以推動生物過程所必需的。然而，在病理條件下，ROS常常過量表達，導致氧化應激[6]。如圖8、圖9所示，與空白組相比，加入LPS后DCF熒光值的增加，細胞內ROS的產(chǎn)生顯著增加。細毛石花菜多糖處理的ROS的產(chǎn)生以濃度依賴的方式減少(P<0.001),這表明細毛石花菜多糖能夠有效降低LPS誘導的ROS生成。

圖8 細毛石花菜多糖對ROS的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide from Gelidium crinale on ROS

圖9 細毛石花菜多糖對ROS的清除作用Fig.9 Scavenging effect of polysaccharide from Gelidium crinale on ROS 注：圖中###表示與空白組比較差異極顯著(P<0.001)； **表示與對照組比較差異極顯著(P<0.01)； ***表示與對照組比較差異極顯著(P<0.001)

2.6 SOD活力水平測定

通過蛋白免疫印跡實驗測定細毛石花菜多糖對SOD活力水平的影響，如圖10所示，與空白組相比，加入LPS后SOD活力水平減小。細毛石花菜多糖處理后SOD活力水平以濃度依賴的方式增加(P<0.001)。這表明細毛石花菜多糖能夠有效提高SOD活力水平。

圖10 細毛石花菜多糖對SOD活力水平的影響Fig.10 The effect of polysaccharide from Gelidium crinale on SOD activity level 注：圖中###表示與空白組比較差異極顯著(P<0.001)；*表示 與對照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與對照組比較差異極 顯著(P<0.01)；***表示與對照組比較差異極顯著(P<0.001)

3 討論

本研究探討了從細毛石花菜中分離出硫酸化多糖的理化性質及抗氧化活性。據(jù)報道，已經(jīng)有研究者從其他地域其他種類的石花菜中提取多糖并對其理化性質及其活性進行研究，而本研究提取的硫酸化多糖的單糖組成主要由半乳糖(63.05%)，巖藻糖(11.19%)和木糖(11.55%)組成，包含大量的半乳糖，測定的分子質量的結果為25.8 kDa，與前人的研究結果相似[23-25]，符合紅藻多糖的基本特征。但是，細毛石花菜多糖的的硫酸基團占比較高(16.50%)，經(jīng)過化學成分測定和FT-IR光譜分析也證明了硫酸基團的存在。據(jù)報道硫酸基團的占比越多，多糖活性越好[26]，因此研究了細毛石花菜多糖的抗氧化活性。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，崔明曉等[27]證明大石花菜多糖質量濃度為20 mg/mL時，超聲提取多糖的ABTS陽離子自由基清除率達到27.77%，在5 mg/mL時，超聲提取多糖的DPPH自由基清除率為26.03%。而在8 mg/mL時，細毛石花菜多糖的DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率分別達到了56.11%和89.10%。由此可見，細毛石花菜多糖具有較好的抗氧化活性。除此以外，細毛石花菜多糖的抗氧化活性在細胞層面得到了進一步驗證。研究結果表明，LPS誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生大量ROS，而SOD酶活性顯著下降。隨著細毛石花菜多糖質量濃度的增加，SOD酶活性顯著增強，ROS含量顯著降低。證明了細毛石花菜多糖可以增強SOD酶活性，從而降低ROS含量。因此，細毛石花菜多糖是具有一定的抗氧化作用。

4 結論

本研究用0.1 mol/L的HCl提取細毛石花菜多糖。化學組成分析顯示，細毛石花菜多糖中總糖占比為70.51%，蛋白質占比為5.27%，還原糖占比為8.42%，硫酸基團占比為16.50%。細毛石花菜多糖主要含有半乳糖，木糖和巖藻糖，且半乳糖所占的比例超過了所有單糖的一半，含量最少的是阿拉伯多糖。用GPC測定細毛石花菜多糖的相對分子質量為25.8 kDa。研究結果表明，細毛石花菜多糖具有清除自由基的能力，還可以增強SOD酶活性，具有一定的抗氧化活性，為后續(xù)深入研究奠定了基礎。