鐵皮石斛鑒定方法與技術的研究進展

陳文強，汪小福，陳笑蕓，彭城，徐俊鋒，蔡健*

(1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.浙江省農業(yè)科學院 農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生型草本植物[1]，是我國常用的傳統(tǒng)中藥材，具有滋陰除熱、生津養(yǎng)胃等功效[2]，被譽為“中華九大仙草”之首[3]。近年來，現代藥理學對鐵皮石斛的成分開展了深入的研究，表明其有效成分具有增加免疫力、抗衰老與氧化等作用[4]。鐵皮石斛鮮枝不易保存[5]，通常會被加工成“楓斗”，鐵皮楓斗是近幾年來頗受歡迎的保健品之一[6]。鐵皮石斛市場需求量大，但其生長規(guī)律以及野生資源的破壞使得產量不足[7]，因而價格昂貴。市場存在利用外觀相似、性質相近的金釵石斛或紫皮石斛等來充當鐵皮石斛原料進行加工和售賣的現象[8]，嚴重影響了鐵皮石斛市場的健康發(fā)展，損害了消費者合法權益。

本文針對鐵皮石斛的組織形態(tài)、顯微鑒定、理化分析和DNA分子生物學鑒定等進行闡述，介紹這幾個方面的研究進展，分析存在的問題或不足，結合新技術的涌現和實際檢測的需要對鐵皮石斛鑒定方法和技術的發(fā)展進行了分析和展望。

1 組織形態(tài)鑒別

組織形態(tài)鑒定主要以鐵皮石斛的表面特征，包括鐵皮石斛的莖、葉、花等器官以及組織學特征為研究對象。通常鐵皮石斛的形態(tài)特征為：莖為叢生，呈直立狀，節(jié)明顯，分節(jié)處略彎曲，有些會呈“Z”狀，通體圓柱；表面暗綠色或黃綠色，葉鞘具有紫色斑點；易折斷，汁較為黏稠，味淡微苦而回味甜，嚼之有濃厚黏性；鮮根近乳白色，老根貼近棕色[9-14]。包英華[15]通過收集不同地區(qū)的鐵皮石斛，根據種內組織形態(tài)變異特征將鐵皮石斛分為9個變異類型：紫桿紅葉型、紅桿紅葉型、青桿細莖型、青桿粗莖型、紡錘粗莖型、矮桿粗莖型、矮桿彎曲型、長桿黑節(jié)型和短桿黑節(jié)型。丁小余等[16]對不同產地的鐵皮石斛進行比較，發(fā)現可分“F”楓斗型與“H”非楓斗型兩類。“F”型總體更為柔軟，具有較為豐富的蠟質與黏多糖，適合加工為優(yōu)質楓斗；“H”型莖較長，質地堅硬，不宜作為鐵皮楓斗的原料。

組織形態(tài)的鑒定是傳統(tǒng)的鐵皮石斛鑒定方法，方便快捷，主要依靠鑒定人的感官分析，基本不需要借助儀器。但對鑒定人的鑒定經驗及材料的新鮮度與完整性要求較高。

2 顯微鑒別

自20世紀80年代之后，隨著顯微技術的進一步發(fā)展，對于鐵皮石斛顯微性狀研究越加精密。趙玉嬌等[17-20]分別根據組織結構、細胞形狀對鐵皮石斛的莖橫切面、薄壁細胞切片、維管束數量以及粉末顯微特征等進行具體描述：莖切面大體呈多邊形，微木化，細胞壁加厚；薄壁細胞也呈多角形，含有大量淀粉顆粒，外側薄壁細胞中含硅質塊，草酸鈣針晶多成束存在，其黏液細胞多貼近表皮處；維管束略排成4～5圈，韌皮部狹小；粉末在顯微鏡下是淡黃色，表觀呈無規(guī)則狀顆粒，均能觀察出淀粉顆粒，多為單粒。蔡沓栗等[14]基于《中華本草》記錄，對鐵皮石斛根、莖、葉進行全面的組織形態(tài)鑒定，細化僅從單一橫切面分析，結合多組織細胞觀察，明確其特征及鑒別方法，確定根橫切面中鐵皮石斛具有明顯木質增厚的外皮層。蔣素華等[21]利用冷凍切片技術，通過光鏡和蔗糖保護，在蔗糖質量分數8%、冷凝溫度-25 ℃的最適條件，觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結構，該方法可在蘭科植物中廣泛應用。同時，不同產地的鐵皮石斛在顯微鑒定比較時無較大區(qū)別。李婭瓊等[22-23]對野生及栽培變異的鐵皮石斛與普通組培鐵皮石斛的顯微特征進行對比，發(fā)現只有在個別部位有些不同，總體上呈現的特征是一樣的。

操作簡便、樣品用量少是顯微性狀鑒定的優(yōu)點，至今仍是中藥材鑒定的常用方法之一。而針對鐵皮石斛的顯微鑒定主要偏向鐵皮石斛與其余藥用石斛之間的差別，缺少明確鑒定鐵皮石斛的專屬性狀顯微特征。

3 理化性質

理化鑒定指利用化學或物理的方法，對鐵皮石斛中所含有效成分進行定性分析，以獲取具有鑒別價值的理化特征，鐵皮石斛中常用的理化鑒定方法包括色譜法、光譜法及質譜法等。

3.1 色譜法

陳曉梅等[24]利用氣相色譜法(GC)分析鐵皮石斛中單糖組成，多糖中甘露糖和葡萄糖相對含量比值可區(qū)分鐵皮石斛與其余石斛。王麗麗等[25]采用裂解氣相色譜(Py-GC)結合系統(tǒng)聚類分析所得的指紋圖譜，能區(qū)別真?zhèn)舞F皮石斛。

孟海濤[26]以鐵皮石斛等3種霍山產石斛(霍山石斛、鐵皮石斛與銅皮石斛)為材料，通過高效液相色譜(HPLC)技術建立霍山產3種石斛葉、莖、花的HPLC指紋圖譜體系，明確鐵皮石斛在(56.57±0.02)min處存在特征色譜峰。黃月純等[27]對不同地區(qū)鐵皮石斛葉片黃酮類成分標示HPLC特征圖譜，表明不同產地種源成分組成和比例存在顯著差異。梁芷韻等[28]優(yōu)化了鐵皮石斛黃酮苷類成分HPLC特征圖譜分析方法，明確指出不同種源的共性成分與特異性成分，可通過參照物峰判斷。宋紅坤等[29]建立鐵皮石斛HPLC特征圖譜，初步比較8個品種石斛HPLC特征圖譜差異，穩(wěn)定可靠，重復性好。吳成鳳[30]對鐵皮石斛黃酮類成分采用超高效液相色譜技術(UHPLC)分析，且得到鐵皮石斛特征圖譜可將其與霍山石斛、細莖石斛成功鑒別。Xu等[31]利用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)建立基于鐵皮石斛多糖成分的HPGPC指紋圖譜，成功鑒定鐵皮石斛與其余石斛。

3.2 光譜法

光譜鑒定分析主要是依據植物材料中所含成分對紅外光或紫外光的吸收峰值疊加后形成相應的光譜，因所含成分及含量不一，所以其所對應的出峰時間、峰形等存在差異，通過比較可實現植物間的鑒別。在鐵皮石斛中常用的光譜鑒定有紫外光譜法與紅外光譜法。鄧星燕[32]通過紫外指紋圖譜與偏最小二乘判別分析建立模法，可將云南5個地區(qū)鐵皮石斛及其余9種藥用石斛均成功鑒別和溯源，且發(fā)現鐵皮石斛莖與葉的紫外指紋圖譜差異很大，經類比后葉的紫外指紋圖譜更具有產地特征。

李兆奎等[33]首次通過紅外光譜法對5種常見藥用石斛(包括鐵皮石斛)進行鑒定分析，在1 700～1 200 cm-1與1 000～700 cm-1處均具有特征峰圖，可將5種石斛成功鑒別。白音[34]對42種藥用石斛進行紅外光譜分析，結果表明，在3 000～2 800 cm-1以及1 800～400 cm-1范圍之內，紅外指紋圖譜存在顯著差異。上述研究說明紅外光譜技術可用于多種藥用石斛鑒別。劉瑞婷[35]通過近紅外光譜技術結合SIMCA模式識別方法對7種不同產地的鐵皮石斛進行鑒別，成功鑒別7個產地的鐵皮石斛；并且針對3種不同品種楓斗完整樣與粉碎樣進行近紅外光譜分析鑒定，均能成功鑒定。劉文杰[36]對不同產地的鐵皮石斛葉、莖、根部位進行多糖紅外光譜分析，得出不同產地鐵皮石斛多糖含量差異很大的結論，由此可將廣西、云南與浙江的鐵皮石斛區(qū)分開。張雪瑛[37]利用傅里葉變換紅外光譜技術得到鐵皮石斛等9種石斛的特征光譜，并對4個產地的鐵皮石斛進行紅外光譜分析，可知在紅外光譜的峰高上存在差異，可作為輔助手段建立鐵皮石斛綜合鑒定體系。

3.3 質譜法

楊健等[38]采用熱電離質譜和穩(wěn)定同位素質譜分別測定鐵皮石斛中鍶元素等，采用主成分分析構建(PCA)模型能夠區(qū)分不同產地的鐵皮石斛。嚴華等[39]采用微波消解法對樣品進行前處理，建立電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)方法來測定鐵皮石斛中5種重金屬元素含量符合現行標準。潘琳琳[40]基于核磁共振(NMR)代謝組分析和最小二乘支持向量機(LS-SVM)模型鑒別鐵皮石斛粉是否摻假，準確性達98%。

Jiao等[41]利用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和液相色譜-質譜聯用(LC-MS)方法，并利用PCA分析，鑒定出78種代謝物。Yang等[42]使用超高效液相色譜飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS)和多變量分析系統(tǒng)地表征了來自不同種源的鐵皮石斛化學特征。將UPLC-Q-TOF-MS數據通過PCA分析，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)顯示出明顯的分離。馬旖旎[43]針對7個不同產地的鐵皮石斛采用頂空固相微萃取技術(HS-SPEM)提取鐵皮石斛的有效成分，并結合GC-MS技術對相應化學成分進行解析，并建立了7個不同產地的鐵皮石斛葉片有效成分的HPLC指紋圖譜體系。Jin等[44]從不同生長年限的鐵皮石斛和霍山石斛莖中萃取分離出代謝物，并使用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)對其進行了鑒定，對11種具有明顯分化的代謝物進行主成分分析(PCA)和OPLS-DA分析，作為鑒定區(qū)分鐵皮石斛和霍山石斛的生物標記。

4 DNA分子生物學鑒定

DNA分子生物學鑒定是以生物大分子核酸的多態(tài)性或特異性為基礎的分子水平鑒定。DNA分子生物學鑒定具有準確性高、數量級多、遍及整個基因組、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點。隨著DNA分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的DNA分子生物學技術被應用到鐵皮石斛的鑒別當中。目前常用的有DNA分子標記方法(如RAPD、ISSR、AFLP等)及DNA條形碼技術等。

4.1 隨機擴增DNA多態(tài)性

RAPD(random amplified polymorphic DNA)技術是以PCR技術為基礎，對不同模板DNA采用隨機合成的寡聚核苷酸序列引物擴增，DNA片段呈現多態(tài)性[45]，僅在某一特定模板中成功擴增即可作為該模板的分子標記。Klinbunga等[46]首先通過對不同屬植物進行擴增，尋找屬間特有的產物，再通過對屬內不同種植物進行擴增，尋找種內特有產物，最后得到種內不同個體之間的差異進行鑒別。顏松[47]利用RAPD技術對鐵皮石斛基因組進行擴增，優(yōu)化反應條件，為該技術在鐵皮石斛的應用奠定基礎。張銘等[48]通過RAPD技術對鐵皮石斛基因組進行擴增，篩選最初設計的50種RAPD引物，成功選出一組對鐵皮石斛具有高度特異性的引物，達到正確鑒別鐵皮石斛與其余藥用石斛的目的。顧慧芬等[49]對鐵皮石斛試管苗采用RAPD技術，成功設計出能特異性鑒定鐵皮石斛的引物，并對其進行多代培育驗證其穩(wěn)定性。丁鴿等[50]對8個不同地區(qū)野生鐵皮石斛進行RAPD技術分析鑒別，成功設計出S412引物，該引物可將8個野生群體準確鑒別，并具有良好的穩(wěn)定和重復性。

4.2 簡單重復序列區(qū)間

ISSR(inter-simple sequence repeat)技術是以微衛(wèi)星重復序列(SSR)為基礎[51]，在其引物3′或5′端錨定2～4個堿基成為新的引物，如[CT]4CG、[AG]4CT等，通過擴增兩側反向SSR序列，電泳后呈現多態(tài)性，分析特征片段并建立進化樹用于屬間及種間資源鑒定等。盧家仕等[52]利用ISSR技術對24份不同石斛屬樣品進行多樣性和聚類分析，可將24份石斛屬分為6個類群，與傳統(tǒng)分類一致。李明焱等[53]采用ISSR技術對新培育的鐵皮石斛幼苗進行分析，成功篩選出鐵皮石斛新品種新斛1號，電泳多態(tài)性與其余品種鐵皮石斛存在明顯差異。段媛媛等[54]采用單因素試驗結合ISSR分子標記技術對霍山石斛與鐵皮石斛進行多態(tài)性分析，篩選出6條多態(tài)性與穩(wěn)定性好的引物，可用于鐵皮石斛與霍山石斛的鑒定。ISSR技術汲取RAPD與SSR技術的長處，既能達到較好的穩(wěn)定性，又具有操作簡便、快速等優(yōu)點。

4.3 擴增片段長度多態(tài)性

AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術利用兩種限制性內切酶對物種基因組DNA進行切割，該方法基于染色體上眾多自然的酶切位點[55]，將堿基差異較大的物種進行快速準確鑒別。Ulrich等[56]在酶切兩端接人工合成接頭作為擴增模板，將人工接頭堿基加上酶切位點堿基往前延伸2～3個堿基為擴增引物，再通過聚丙烯酰胺凝膠放射熒光，通過銀染技術得到多態(tài)性條帶。王慧中等[57]利用AFLP技術對13種石斛屬植物進行遺傳多樣性研究，成功篩選出3對選擇性擴增引物組合，將13種材料分成3類，與傳統(tǒng)分類學結果基本一致。宋爽等[58]同樣對51個藥用石斛(包括35個鐵皮石斛)利用AFLP技術篩選出5對特征引物，成功將鐵皮石斛與其余石斛鑒別。

4.4 DNA條形碼技術

目前，DNA條形碼作為中藥分子鑒定中的熱點，自2003年加拿大圭爾夫大學Paul Hebert教授提出后，被生物界廣泛關注。生命條形碼聯盟(CBOL)[59]對陸地907個植物樣品進行研究，認為rbcL和matK片段具有很好的分辨能力，將這兩個片段聯合作為陸地植物的DNA條形碼。王暉等[60]利用rbcL和matK對石斛屬的5種石斛進行了鑒別，但是這兩個基因在種內的變異率很低，不建議作為鑒別石斛屬的候補DNA條形碼。中國植物條形碼工作組[61]對1 757個種的序列分析發(fā)現，ITS2和psbA-trnH片段具有更好的鑒定能力，將ITS2+psbA-trnH聯合片段作為中藥分子鑒定的通用條形碼。鐘志敏[62]研究將鐵皮石斛與其余藥用石斛進行了鑒別，發(fā)現ITS2、matK以及yclb1對于石斛屬具有良好的鑒別能力。丁小余等[63]分別對楓斗類石斛ITS區(qū)全序列、nad1-intron2片段全序列、cp DNA psdA-trnH全序列進行分析鑒別，并利用位點特異性PCR對“F”型鐵皮石斛與“H”型鐵皮石斛ITS2序列分析，在第273位上找到SNP位點，針對該位點設計引物鑒別兩種不同品質的鐵皮石斛。圖1為鐵皮石斛DNA條形碼鑒別流程。

圖1 DNA條形碼鑒別的流程

4.5 其他DNA分子生物學技術

劉玲等[64]利用目標區(qū)域擴增多態(tài)性TRAP(target region amplification polymorphism)技術對鐵皮石斛群居及其雜交后代進行分子鑒別，通過對鐵皮石斛中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)構建目標區(qū)域，呈現多態(tài)性擴增，篩選出7對引物成功將鐵皮石斛野生群居鑒別，同時對雜交后代進行鑒別，能有效將親本與后代區(qū)分，有利于選擇優(yōu)質品種進行人工培育。TRAP技術根據目的基因序列隨機設計引物進行多態(tài)性標記，優(yōu)點是極大地提高基因型與表現型一致。

此外還有簡單重復序列[65](simple sequence repeat，SSR)、相關序列擴增多態(tài)性[66](sequence related amplified polymorphism，SRAP)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、抑制消減雜交[67](suppression subtractive hybridization，SSH)等技術在鐵皮石斛鑒定研究中的應用。

5 展望

傳統(tǒng)的鐵皮石斛鑒別方法主要依據不同石斛的特征形狀或性狀對石斛的質量或真?zhèn)芜M行評價與鑒別。然而石斛的外觀極其相似，特別是相關近緣種，很難鑒別，如果是加工品如鐵皮楓斗，就更加難以區(qū)分。因此，目前針對鐵皮石斛的鑒定方法主要有兩類，一類是理化分析方法，另一類是DNA分子生物學方法。

理化分析方法檢測和分析的主體是鐵皮石斛中的化學成分或元素，而鐵皮石斛中的化學成分或元素多樣，且受多種因素的影響，如氣候環(huán)境、種質資源、栽培方式等。另一方面，目前的鑒定方法多基于單一或少數指標性成分的檢測，缺乏專屬性和特異性，無法對不同石斛進行精準的鑒別。隨著色譜特別是質譜技術的發(fā)展，近年來基于質譜技術的代謝組學為理化分析方法提供了新的選擇，代謝組學基于高通量分析技術，如核磁共振、色譜質譜和毛細管電泳質譜等技術，對鐵皮石斛小分子代謝產物的組成、含量及其變化進行定性和定量分析，通過代謝物信息與其生理變化的關聯分析，尋找鐵皮石斛的特征代謝標志物，從而克服了目前其他理化方法檢測目標單一或缺乏特異性的不足。

基于DNA分子的鑒別方法，直接從DNA分子水平反映植物物種的多樣性和特異性。DNA分子受外界因素以及生物體發(fā)育階段及器官組織差異等的影響較小，DNA分子相對穩(wěn)定和便于操作，使得DNA分子鑒定技術在鐵皮石斛的鑒別方面具有準確性高、重現性好等優(yōu)勢。然而目前無論是DNA分子標記技術還是DNA條形碼技術，其檢測過程仍然繁雜，而且分辨率有待提高。近年來，三代測序技術的發(fā)展，使得測序的時間及成本大大縮短與降低，因此，有望利用測序技術達到對鐵皮石斛的精確鑒定。

鐵皮石斛鑒定是一個跨學科交叉的研究領域。就目前的技術而言，主要為上述理化分析技術和DNA分子生物學技術。然而任何一項技術都不是萬能的，每項技術都有各自的特色。為了達到鑒定的目的，技術的多元化交叉和聯合是當前及未來的發(fā)展趁勢。而最終的目的主要有兩方面，即精確鑒定和快速鑒定。為了達到精確鑒定，一方面在現有技術的基礎上升級改造和提升，另一方面是吸納和引入新的技術，如代謝組及其他組學的發(fā)展，多組學的聯合應用也為鐵皮石斛的鑒定提供了新選擇；三代測序技術的發(fā)展，為基于DNA序列信息的鐵皮石斛精確鑒別提供了可能；再如利用數字PCR技術對鐵皮石斛進行精準定量分析。在快速檢測方面，以電子鼻、電子舌等各類傳感器為代表的智能快檢技術有望應用于鐵皮石斛的快速檢測與鑒定。另一方面，將新興的芯片技術、恒溫擴增技術、功能納米材料、微流控技術及光電技術進行融合，從而打造針對鐵皮石斛快速鑒定的新技術。