MsRCI2A/B/C基因超量表達(dá)對(duì)紫花苜蓿耐旱性的影響

才 華，李淳馨，叢春龍，戰(zhàn)力峰，何 凱，董 理，許慧慧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)屬多年生豆科植物，是世界上種植最廣泛的牧草之一[1-3]。其不但具有蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn)，而且產(chǎn)量也很高，素有“牧草之王”的美稱[4-7]。然而我國(guó)北方地區(qū)降水量少、蒸發(fā)量大，干旱已成為制約紫花苜蓿生產(chǎn)的主要逆境因子[8]。植物受到干旱脅迫后，會(huì)啟動(dòng)一系列相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而引起生理生化及代謝途徑的應(yīng)激反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干旱的響應(yīng)[9-12]。多項(xiàng)研究表明，干旱脅迫后苜蓿細(xì)胞外滲液的電導(dǎo)率較低[13]，而苜蓿幼苗中的脯氨酸顯著累積[14]，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)K+[15]和內(nèi)源激素ABA[16]的含量也明顯增加。另外，逆境條件下活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致苜蓿膜系統(tǒng)損傷和細(xì)胞傷害，而干旱脅迫下苜蓿也會(huì)通過(guò)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等氧化酶類的響應(yīng)來(lái)減緩和抵御細(xì)胞傷害[17]。

RCI2(rare cold inducible 2)是高度保守的小分子疏水多肽，其所編碼的小的膜蛋白屬于PMP3(plasma membrane protein 3)蛋白。RCI2/PMP3類基因作為多基因家族普遍存在，與非生物脅迫響應(yīng)緊密相關(guān)[18]，具有調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用。RCI2蛋白在鹽、干旱和冷脅迫中都發(fā)揮著一定的作用，并通過(guò)超量表達(dá)RCI2轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性得以證實(shí)[19-22]。例如，Mitsuya等[19]發(fā)現(xiàn)，與野生型植物相比，AtRCI2A過(guò)表達(dá)植物生長(zhǎng)受鹽的影響較小，AtRCI2A的過(guò)表達(dá)可限制與鹽脅迫相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，還可以減輕鹽脅迫引起的光氧化傷害;水稻基因OsRCI2-5(受干旱和強(qiáng)冷誘導(dǎo))過(guò)表達(dá)可有效增強(qiáng)耐旱性[20];超量表達(dá)樟毛屬濱患木植株中的ALTMP1和ALTMP2基因，可以提高煙草的耐鹽、耐旱、耐冷及滲透脅迫等能力[21-22]。

紫花苜蓿中存在6個(gè)RCI2基因，分別是Ms-RCI2A/B/C/D/E/F。根據(jù)其C末端氨基酸的序列特征，將這6個(gè)RCI2基因分為Ⅰ、Ⅱ類，其中MsRCI2A-C為Ⅰ類，C末端不含有疏水氨基酸；MsRCI2D-F為Ⅱ類，C末端含有疏水氨基酸。Long等[23]研究表明,MtRCI2A-C可以功能互補(bǔ)酵母pmp3突變體，并定位于細(xì)胞膜，而MtRCI2D和MtRCI2E不能功能互補(bǔ)酵母pmp3突變體，不僅位于細(xì)胞膜，內(nèi)膜中也有定位，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；MtRCI2E和MtRCI2D基因在鹽脅迫下表達(dá)變化并不顯著，而MsRCI2A和MtRCI2A基因的表達(dá)受鹽脅迫影響最大。綜上所述，RCI2基因與眾多非生物脅迫相關(guān)，但在苜蓿中與干旱相關(guān)的研究較少。本研究克隆了紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因，分析3個(gè)基因在20% PEG6000模擬干旱條件下的表達(dá)差異；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得超量表達(dá)MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的轉(zhuǎn)基因苜蓿，對(duì)干旱條件下轉(zhuǎn)基因苜蓿表型和生理指標(biāo)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐旱性，以期為苜蓿基因工程改良提供基因資源，并為提高干旱地區(qū)的苜蓿產(chǎn)量提供轉(zhuǎn)基因育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿種子龍牧806，購(gòu)自黑龍江省畜牧研究所。根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。各種載體和菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物工程實(shí)驗(yàn)室保存并提供；所用引物(表1)的合成及測(cè)序工作由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理 紫花苜蓿龍牧806種子經(jīng)春化處理后，置于鋪有潤(rùn)濕濾紙的平皿中，將平皿置于溫度22～25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16 h光照，8 h黑暗)。待幼芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)移入蛭石中培養(yǎng)，澆灌1/5 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。15 d后移至1/5 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行水培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。

待幼苗適應(yīng)4～5 d后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的PEG6000模擬干旱處理，在干旱脅迫處理前(0 h)及處理后的2，4，8，12和24 h分別取紫花苜蓿葉和根各200 mg，樣品標(biāo)記后迅速于液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每個(gè)組織設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2MsRCI2A/B/C基因擴(kuò)增及表達(dá)分析 根據(jù)RCI2類基因家族成員登錄號(hào)(表2)查找目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的引物(表1)。使用RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)公司生產(chǎn))提取紫花苜蓿總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

分別提取干旱脅迫處理后紫花苜蓿葉和根中的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后用qPCR檢測(cè)Ms-RCI2A/B/C基因的表達(dá)水平，所用引物見(jiàn)表1。目的基因表達(dá)量的相對(duì)變化采用2-ΔΔCt法計(jì)算，每個(gè)株系設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

表2 苜蓿中RCI2類基因家族成員的登錄號(hào)Table 2 Accession number of RCI2 gene family members in alfalfa

1.2.3MsRCI2A/B/C植物表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)MsRCI2A/B/C基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，設(shè)計(jì)相應(yīng)的帶有酶切位點(diǎn)XmaⅠ、SpeⅠ的引物(表1中下劃線部分)，通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切連接的方法直接連接到線性植物表達(dá)載體pMDC123，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體pMDC123-MsRCI2A/B/C。

1.2.4 轉(zhuǎn)MsRCI2A/B/C基因苜蓿的獲得 采用凍融法，將構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，誘導(dǎo)苜蓿子葉節(jié)再生植株，以1.0 mg/L草銨膦篩選抗性植株。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2和C10。

1.2.5 相關(guān)生理指標(biāo)的檢測(cè) 對(duì)野生型株系WT(對(duì)照)和6個(gè)超量表達(dá)的苜蓿株系(A12、A22、B13、B19、C2和C10)進(jìn)行扦插，枝條浸蘸生根粉，在蛭石中生根10周左右。選取長(zhǎng)勢(shì)相同的苜蓿株系，用20% PEG6000溶液澆灌模擬干旱處理，在脅迫0，6和12 d后，對(duì)超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2、C10及WT的表型進(jìn)行拍照觀察。然后用TYS-B葉綠素儀(中國(guó)峰龍化學(xué)儀器公司)測(cè)定植株的相對(duì)葉綠素含量(SPAD)。采用抽真空法，利用電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器公司)測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率。選取葉片和根部組織，于液氮中凍存，用于各生理指標(biāo)(丙二醛(MDA)、脯氨酸和可溶性糖含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性)的測(cè)定。同時(shí)以正常水分條件下生長(zhǎng)的苜蓿為對(duì)照。各指標(biāo)均采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，按照蘇州科銘生物有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)整理與分析

使用Microsoft Excel 2000對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用GraphPad prism 5.0對(duì)最終數(shù)據(jù)作圖，用ttest對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿、蒺藜苜蓿及擬南芥中RCI2類基因序列比對(duì)

為了確定基因的同源性，將測(cè)序獲得的Ms-RCI2A/B/C基因序列與Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的8個(gè)擬南芥AtRCI2s基因和3個(gè)蒺藜苜蓿Mt-RCI2s基因進(jìn)行了多序列比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。由圖1和表3可知，苜蓿中的RCI2類基因成員間序列高度相似，與擬南芥RCI2基因氨基酸序列的一致性均低于90%；MsRCI2A/B/C基因C末端不含有疏水氨基酸，屬于Ⅰ類RCI2[23]。另外，紫花苜蓿MsRCI2A/B/C基因與蒺藜苜蓿Mt-RCI2A/B/C基因的相似性均大于97.58%，但也存在個(gè)別氨基酸的差異。

表3 紫花苜蓿MsRCI2A/B/C基因和蒺藜苜蓿MtRCI2A/B/C基因序列的比對(duì)Table 3 Sequence alignment of MsRCI2A/B/C genes and MtRCI2A/B/C genes

2.2 干旱脅迫下RCI2類基因表達(dá)的差異

在20% PEG6000模擬干旱脅迫處理前及處理后的2，4，8，12和24 h,分別取紫花苜蓿葉和根，分析干旱脅迫下RCI2類基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，紫花苜蓿葉片中的MsRCI2A/B/C基因均受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)，MsRCI2A和MsRCI2C基因在干旱脅迫處理2 h即極顯著上調(diào)(P<0.01)，而MsRCI2B的表達(dá)相對(duì)緩慢，在處理8 h時(shí)極顯著上升(P<0.01)。在根中，MsRCI2A/B/C基因在干旱脅迫處理2 h時(shí)表達(dá)極顯著下降(P<0.01)。由此可見(jiàn)，MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因均屬于干旱早期應(yīng)答的基因，雖其在根和葉中表達(dá)變化趨勢(shì)相反，但3個(gè)基因在同一組織中的表達(dá)趨勢(shì)相似。

2.3 超量表達(dá)MsRCI2A/B/C基因苜蓿的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿子葉節(jié)的方法，獲得干旱抗性轉(zhuǎn)基因苜蓿。對(duì)抗性轉(zhuǎn)基因苜蓿進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3和4。由圖3和4可知，成功獲得了超量表達(dá)MsRCI2A基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿A12、A22，超量表達(dá)MsRCI2B基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿B13、B19及超量表達(dá)MsRCI2C基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿C2、C10。

2.4 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的表型特征

對(duì)轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)12、A22、B13、B19、C2和C10與野生型苜蓿(WT)同時(shí)進(jìn)行20% PEG6000模擬干旱脅迫處理，在干旱脅迫0，6 和12 d后，對(duì)正常水分條件下和干旱脅迫下的轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿(WT)的表型進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，在正常條件下，WT和各轉(zhuǎn)基因株系在表型上并無(wú)太大差異；但在干旱脅迫處理6 d時(shí)，WT的生長(zhǎng)受到明顯抑制，而各轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)幾乎未受到影響；在干旱脅迫處理12 d時(shí)，WT葉片枯萎現(xiàn)象嚴(yán)重，而各轉(zhuǎn)基因株系只有部分葉片發(fā)黃枯萎?；诟珊得{迫下的表型觀察發(fā)現(xiàn)，與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系抗旱性更強(qiáng)。

2.5 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿葉綠素含量和葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

為了確定干旱脅迫對(duì)苜蓿生理指標(biāo)的影響，測(cè)定了6個(gè)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿與野生型紫花苜蓿(WT)植株葉片的葉綠素含量及相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，在正常條件下，除C2和C10外，各轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量與WT并無(wú)明顯差異；干旱脅迫6 d時(shí)，WT植株的葉綠素含量下降最為明顯；脅迫12 d時(shí)，各轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量極顯著高于WT(P<0.01)，A12、A22、B13、B19、C2和C10植株的葉綠素含量分別是WT葉綠素含量的3.08，3.46，3.23，3.00，3.23和3.22倍。相對(duì)電導(dǎo)率的變化與葉綠素含量的變化相反，脅迫6 d后，WT植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率明顯上升，脅迫12 d時(shí)轉(zhuǎn)基因各株系的相對(duì)電導(dǎo)率均極顯著低于WT植株(P<0.01)。

2.6 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿MDA含量和抗氧化酶活性的影響

為了研究干旱脅迫下苜蓿膜脂氧化程度和抗氧化能力，測(cè)定了6個(gè)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿WT根和葉中的MDA含量及抗氧化酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7顯示，在正常生長(zhǎng)條件下，WT和轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片和根中的MDA含量并無(wú)太大差異；干旱脅迫6 d時(shí)，WT植株葉和根中的MDA極顯著高于轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)；脅迫12 d時(shí)，WT植株葉和根中的MDA含量分別是轉(zhuǎn)基因植株的2.2和2.3倍?？梢?jiàn)各轉(zhuǎn)基因株系膜脂損傷程度更低，耐旱性更強(qiáng)。與之對(duì)應(yīng)，正常條件下轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿株系葉和根中的SOD、POD和CAT活性均高于WT植株，其中B13、B19、C2和C10葉片中的SOD活性是WT的2倍，B13、B19、C2和C10葉和根中的POD活性也均顯著高于WT(P<0.05)。在干旱脅迫6 d時(shí)，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系葉和根中的SOD、POD、CAT活性均顯著或極顯著高于WT；而在脅迫12 d時(shí)，6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉和根中的SOD、POD、CAT活性持續(xù)上升，均顯著或極顯著高于WT，其中以CAT活性差異最為顯著。由此可知，MRCI2A/B/C基因的超量表達(dá)，可以激活植株干旱脅迫下的抗氧化酶系統(tǒng)，從而使轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力強(qiáng)于野生型，并降低了膜脂氧化水平。

2.7 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力的影響

PEG6000模擬干旱是通過(guò)調(diào)節(jié)植物滲透壓的變化造成植物生理性干旱。為了分析轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，測(cè)定了6個(gè)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿株系及野生型紫花苜蓿(WT)干旱脅迫前后根、葉中脯氨酸和可溶性糖含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)，在正常條件下，各轉(zhuǎn)基因株系紫花苜蓿根、葉中的可溶性糖含量與WT無(wú)顯著性差異；干旱脅迫6 d時(shí)，除A12外，其他株系葉中的可溶性糖含量顯著升高，而根中變化不明顯；干旱脅迫12 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因各株系葉和根中的可溶性糖含量分別是WT的1.75和1.70倍。脯氨酸含量的變化與可溶性糖含量相似，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因苜蓿中的脯氨酸含量與WT 差異不顯著；干旱脅迫6 d后，各轉(zhuǎn)基因株系根和葉中的脯氨酸含量均明顯上升，極顯著高于WT(P<0.01)；干旱脅迫12 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與WT的差異更為顯著(P<0.01)。由此可見(jiàn)，在干旱脅迫條件下，MsRCI2A/B/C基因的超量表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而對(duì)苜蓿細(xì)胞起到一定的滲透保護(hù)作用。

3 討論與結(jié)論

RCI2類基因可響應(yīng)多種非生物脅迫，超量表達(dá)的RCI2類基因可顯著提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性，如超量表達(dá)紫花苜蓿MsRCI2A基因可以提高擬南芥的耐鹽性[19]；超量表達(dá)OsRCI2類基因可以提高水稻的抗旱性[24]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿葉中的MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在干旱脅迫條件下相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，以MsRCI2A基因的變化幅度最大；而在根中3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均明顯下降，且在根中的變化幅度更為顯著。這表明MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C3個(gè)基因在干旱脅迫下響應(yīng)迅速，且均參與了干旱的早期應(yīng)答。但是即使3個(gè)基因高度同源，其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)也存在差別。值得注意的是，干旱脅迫條件下MsRCI2s基因在紫花苜蓿根和葉中的表達(dá)存在相反的變化趨勢(shì)。擬南芥8個(gè)AtRCI2s基因中，At-RCI2A/B/D/F4個(gè)基因在根中的表達(dá)量明顯高于葉片；而在葉片中，除AtRCI2C外的其他7個(gè)基因均表現(xiàn)為干旱上調(diào)表達(dá)，其中以AtRCI2A/F的上調(diào)最為顯著[18]。玉米中的8個(gè)PMP3基因在干旱條件下的表達(dá)模式也各不相同，但并未顯示出地上和地下明顯相反的表達(dá)模式[25]。雖然目前對(duì)Ms-RCI2A/B/C基因在苜蓿根和葉中的差異表達(dá)機(jī)制尚不明確，但可以確定的是，其在根和葉中響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制并不相同。

我國(guó)干旱地區(qū)主要集中在北方，而干旱脅迫會(huì)對(duì)植物造成一系列的傷害，進(jìn)而影響植物的形態(tài)、生理和生化功能[26]。本研究中，MsRCI2A/B/C基因的超量表達(dá)可明顯提高苜蓿的耐旱能力，主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因苜?？寡趸芰皾B透調(diào)節(jié)能力提高，膜脂氧化程度下降，細(xì)胞膜穩(wěn)定性增強(qiáng)?；诖耍J(rèn)為該類基因可應(yīng)用于苜蓿耐旱的分子育種。

由于RCI2是較小的膜蛋白，并不能單獨(dú)進(jìn)行離子轉(zhuǎn)運(yùn)，因此很多研究推測(cè)其可能是通過(guò)修飾或調(diào)控其他膜蛋白而發(fā)揮功能。有研究表明，RCI2與糖滲透酶(Mal31)、氨基酸滲透酶(Gap1 和Agp1)、 S-甲基甲硫氨酸通透酶(Mmp1)和氨通透酶(Ydr307w、 Mep2)存在相互作用[27-28]。說(shuō)明與這些酶相互作用或許可以改變物質(zhì)的通透性和細(xì)胞的滲透壓。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后，轉(zhuǎn)MsRCI2A/B/C基因紫花苜蓿植株可溶性糖和脯氨酸含量大量積累，推測(cè)MsRCI2s蛋白可能通過(guò)調(diào)控其他膜蛋白或者與其他蛋白相互作用改變可溶性物質(zhì)的積累和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而間接參與干旱應(yīng)答過(guò)程，然而具體的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，紫花苜蓿MsRCI2A/B/C基因可響應(yīng)干旱脅迫，但其在根和葉中存在不同的表達(dá)模式。MsRCI2A/B/C基因的超量表達(dá)均可提高紫花苜蓿對(duì)干旱脅迫的耐性，說(shuō)明這3個(gè)基因可應(yīng)用于苜蓿的遺傳改良。