miR-1307-3p通過靶向ISM1促進乳腺癌細胞的增殖和遷移

陸旭陽，劉奕，李曉輝，黃欣，黃翠霞，馬書祥，竇偉瑜，曾麒燕，2△

乳腺癌發(fā)病率逐年上升，已成為女性患者癌癥死亡的主要原因［1］。盡管放化療及多種輔助治療極大提高了患者的生存質(zhì)量，但由于乳腺癌細胞的異質(zhì)性，乳腺癌轉(zhuǎn)移依然是目前難以攻克的問題［2］。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，其通過與靶基因3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的表達［3］，參與細胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡等多種生物過程［4］。研究表明，miRNA在乳腺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［5-6］，有望成為乳腺癌診治的靶標。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，過表達linc00324可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，減少侵襲和遷移，增加細胞凋亡；通過MS2-RIP測序發(fā)現(xiàn)，linc00324可與多種miRNA相互作用，其中包括miR-1307-3p［7］，但其在乳腺癌中的作用鮮有報道。本研究旨在分析miR-1307-3p對乳腺癌細胞增殖、遷移、凋亡等方面的影響，并初步分析其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人乳腺正常上皮細胞系MCF-10A，人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青/鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit、miR-1307-3p類似物（mimics）或抑制物（inhibitor）及相應(yīng)的陰性序列（control）購自廣州銳博公司，序列見表1。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。RNA提取試劑盒購自美國賽默飛公司；總RNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自日本DOJINDO公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。多功能酶標儀（Thermo公司，美國），實時熒光定量PCR儀（ABI，美國），超凈工作臺（蘇潔醫(yī)療器械有限公司，蘇州），倒置顯微鏡（Olympus，日本），流式細胞儀（Beckman-Coulter公司，美國）。

Tab.1 Sequence for miRNA mimics or inhibitor表1 miRNA類似物或抑制物序列

1.2 方法

1.2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-1307-3p在乳腺癌患者中的表達水平及其與臨床指標的關(guān)系 利用TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）分析miR-1307-3p在不同腫瘤中的表達水平，進一步從數(shù)據(jù)庫中獲取1 068例乳腺癌患者和104例正常乳腺組織的資料，分析miR-1307-3p在乳腺癌組織中的表達水平，并分析其與臨床指標的關(guān)系。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將人乳腺正常上皮細胞株MCF-10A及人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 MCF-7細胞以3×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞密度為70%時，用4μg mimics、mimics-control、inhibitor和inhibitor-control進行轉(zhuǎn)染，以未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照，培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 總RNA提取及qPCR TRIzol法提取轉(zhuǎn)染后細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，檢測mRNA和miRNA表達水平，分別以GAPDH和U6為內(nèi)參。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃2 s，60℃20 s，70℃10 s，共35個循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示miR-1307-3p、ISM1相對表達水平。引物由日本Takara公司合成，序列見表2。

Tab.2 Primer sequence for qPCR表2 qPCR引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測miR-1307-3p對MCF-7細胞增殖能力的影響 將轉(zhuǎn)染mimics和mimics control的細胞于96孔板中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞2 h后，檢測450 nm處吸光度（A）值，以此反映細胞增殖能力。

1.2.6 劃痕實驗分析miR-1307-3p對MCF-7細胞遷移能力的影響 MCF-7細胞以3×105個/孔接種于6孔板，按1.2.3轉(zhuǎn)染。待細胞密度達90%時，用小槍頭在孔中劃線，PBS洗去脫落細胞后，加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h或48 h后，用Image J軟件分析劃痕愈合率。愈合率=（0 h劃痕面積-24 h或48 h的劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.7 流式細胞術(shù)分析miR-1307-3p對MCF-7細胞凋亡的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，加入AnnexinⅤ-FITC（0.5 mg/L），15 min后，加入碘化丙啶（5 mg/L），上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 通過miRDB、miRWalk、TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-1307-3p的靶基因。同時，應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織中靶基因的表達水平，并分析其在不同病理分期中的表達差異。

1.2.9 雙熒光素酶實驗 通過PCR擴增ISM1的3′-UTR序列，克隆至pGLO質(zhì)粒構(gòu)建野生型質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建3′-UTR的突變型質(zhì)粒。取對數(shù)生長期MCF7細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。將miR-1307-3p mimics與ISM1 3′-UTR野生型或突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，并以mimics control為對照。轉(zhuǎn)染48 h后，參照試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1307-3p在乳腺癌組織的表達水平顯著上調(diào) TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，miR-1307-3p在乳腺癌組織中的表達水平最高（圖1）；乳腺癌組織中miR-1307-3p的表達水平高于正常乳腺組織（11.17±0.04vs.10.38±0.11，t=6.372，P＜0.01）；有淋巴轉(zhuǎn)移者miR-1307-3p表達水平低于無淋巴轉(zhuǎn)移者，見表3。

Fig.1 The expression of miR-1307-3p in different tumors with analyzed by TCGA data圖1 利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-1307-3p在不同腫瘤中的表達水平

Tab.3 The relationship between the expression of miR-1307-3p and the clinical indicators in breast cancer patients表3 不同臨床特征的乳腺癌患者的miR-1307-3p表達水平比較 （±s）

Tab.3 The relationship between the expression of miR-1307-3p and the clinical indicators in breast cancer patients表3 不同臨床特征的乳腺癌患者的miR-1307-3p表達水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；#數(shù)據(jù)存在缺失值。

患者臨床特征年齡>60歲≤60歲TNM分期#Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ腫瘤直徑#≤2 cm>2 cm淋巴轉(zhuǎn)移#n miR-1307-3p相對表達量t 480 588 11.05±1.37 11.23±1.29 1.836 781 264 11.20±1.35 11.04±1.28 1.761 276 749 11.15±1.24 11.17±1.36 0.177有無547 324 11.13±1.32 11.39±1.33 3.214＊＊

2.2 乳腺癌細胞中miR-1307-3p表達變化 乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-1307-3p的相對表達水平明顯高于正常乳腺細胞MCF-10A，見圖2。

2.3 過表達和沉默miR-1307-3p的效果 qPCR分析表明，miR-1307-3p mimics組的miR-1307-3p表達水平是mimics control組的15.13倍，而轉(zhuǎn)染miR-1307-3p inhibitor后miR-1307-3p表達水平下調(diào)約57%，見圖3。

2.4 過表達miR-1307-3p促進MCF-7細胞的增殖 與mimics control組相比，miR-1307-3p mimics組細胞A450值明顯增高，見圖4。

Fig.2 The expression of miR-1307-3p analyzed by qPCR in different breast cells lines圖2 qPCR分析不同乳腺細胞株中miR-1307-3p表達量

Fig.3 qPCR verified the expression of miR-1307-3p in MCF-7 cells transfected with miR-1307-3p mimics or inhibitor圖3 qPCR驗證miR-1307-3p-mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后miR-1307-3P的表達水平

Fig.4 Overexpression of miR-1307-3p promotes the proliferation of MCF-7 cells圖4 miR-1307-3p過表達促進MCF-7細胞的增殖

2.5 過表達和沉默miR-1307-3p后MCF-7細胞遷移能力的變化 劃痕實驗顯示，與空白組和mimics control組相比，miR-1307-3p mimics組在24 h和48 h的遷移能力顯著增強，見圖5、表4。與空白組和inhibitor control組相比，miR-1307-3p inhibitor組在24 h和48 h的遷移能力則顯著減弱，見圖6、表5。

Fig.5 The effects of miR-1307-3p overexpression on the migration abilities of MCF-7 cells圖5 miR-1307-3p過表達對遷移能力的影響

Fig.6 The effects of miR-1307-3p silence on migration abilities of MCF-7 cells圖6 miR-1307-3p沉默對遷移能力的影響

Tab.4 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the overexpression of miR-1307-3p表4 miR-1307-3p過表達后各組MCF-7細胞遷移能力比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the overexpression of miR-1307-3p表4 miR-1307-3p過表達后各組MCF-7細胞遷移能力比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與mimics control組比較，P＜0.05。

組別空白組mimics control組miR-1307-3p mimics組F 24 h遷移率（%）16.87±2.97 14.13±3.22a 43.06±6.22ab 13.264＊＊48 h遷移率（%）32.51±3.26 26.28±7.39a 60.13±7.46ab 12.363＊＊

2.6 miR-1307-3p-inhibitor誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡 空白組、inhibitor control組和inhibitor組細胞凋亡 率 分 別 為（4.54±0.395）%、（4.94±0.423）%和（11.90±0.367）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=107.327，P＜0.01），抑制miR-1307-3p表達后MCF-7細胞凋亡率升高，見圖7。

2.7 miR-1307-3p可調(diào)控ISM1基因的表達 通過miRDB、miRWalk、TargetScan數(shù) 據(jù) 庫 預(yù) 測miR-1307-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)ISM1可能是其靶基因之一，相互作用位點見圖8A。雙熒光素酶實驗顯示，與對照質(zhì)粒相比，miR-1307-3p mimics與ISM1 3′-UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細胞熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01）；而miR-1307-3p mimics與ISM1 3′-UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性與對照質(zhì)粒相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖8B。經(jīng)qPCR分析發(fā)現(xiàn)，miR-1307-3p過表達明顯下調(diào)MCF-7細胞中ISM1的表達，沉默miR-1307-3p表達后，MCF-7細胞中ISM1的表達明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖9。

Tab.5 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the downrgulation of miR-1307-3p表5 miR-1307-3p表達下調(diào)后各組MCF-7細胞遷移能力比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the downrgulation of miR-1307-3p表5 miR-1307-3p表達下調(diào)后各組MCF-7細胞遷移能力比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與inhibitor control組比較，P＜0.05。

組別空白組inhibitor control組miR-1307-3p inhibitor組F 24 h遷移率（%）20.2±3.27 19.4±3.52a 11.2±2.82ab 8.373＊48 h遷移率（%）36.3±3.76 40.1±6.52a 25.1±3.46ab 11.1840＊＊

2.8 乳腺癌患者ISM1的表達水平及與病理分期的關(guān)系 進一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析1 085例乳腺癌組織中ISM1的表達水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ISM1的表達水平明顯低于正常乳腺組織（P＜0.01），見圖10A。不同病理分期乳腺癌患者的ISM1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖10B。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中ISM1啟動子的甲基化水平明顯高于正常乳腺組織（P＜0.01），見圖10C。

3 討論

Fig.7 The apoptosis of MCF-7 cells after transfection with miR-1307-3p inhibitor analyzed by flow cytometry圖7 流式細胞術(shù)分析miR-1307-3p沉默表達對MCF-7細胞凋亡的影響

Fig.8 Prediction and validation of the targeting relationship between ISM1 and miR-1307-3p圖8 ISM1與miR-1307-3p靶向關(guān)系的預(yù)測與驗證

Fig.9 miR-1307-3p regulates the expression of ISM1 gene圖9 miR-1307-3p可調(diào)控ISM1基因的表達水平

Fig.10 The expression of ISM1 in breast cancer analyzed with TCGA database圖10 TCGA數(shù)據(jù)庫分析ISM1在乳腺癌中的表達情況

miRNA是一類長度為18~26 bp的小分子非編碼RNA，通過調(diào)控基因表達，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和代謝等各種生理和病理過程［8-9］。研究表明，miRNAs的異常表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與腫瘤血管形成、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤耐藥等過程［10］。miR-1307-3p是與癌癥相關(guān)的miRNA，可促進腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥［11-13］。研究發(fā)現(xiàn)miR-1307-3p的表達水平在乳腺癌患者中顯著上調(diào)，可用于乳腺癌的早期診斷［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-1307-3p在乳腺癌組織中的表達水平明顯上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-1307-3p在乳腺癌細胞株中的表達水平也明顯升高，并促進乳腺癌細胞的增殖和遷移，miR-1307-3p抑制劑可誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，提示miR-1307-3p的異常表達可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。然而，利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-1307-3p在乳腺癌患者中的表達水平時，卻發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的miR-1307-3p水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的患者，這與體外實驗結(jié)果矛盾，由于miR-1307-3p水平是來自數(shù)據(jù)庫中的RNA芯片數(shù)據(jù)，后續(xù)的研究中將進一步收集乳腺癌組織樣本，驗證miR-1307-3p與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

目前一般認為miRNA主要通過與靶基因miRNA的3′-UTR互補結(jié)合而抑制靶基因的翻譯，以調(diào)控靶基因的表達水平［15］。為探明miR-1307-3p的作用機制，首先需要尋找其靶基因。本研究通過miRDB、miRWalk、TargetScan預(yù)測ISM1的3′-UTR區(qū)存在與miR-1307-3p互補結(jié)合的位點，并通過雙熒光素酶實驗證實ISM1是miR-1307-3p的靶基因，與Zheng等［16］報道一致。進一步發(fā)現(xiàn)，過表達miR-1307-3p可下調(diào)ISM1的表達水平，抑制miR-1307-3p表達則上調(diào)ISM1的表達水平。ISM1最初被鑒定為與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因［17］。目前關(guān)于ISM1的研究甚少，有研究報道ISM1在膽管癌患者中的水平顯著下調(diào)［18］，ISM1過表達可抑制人腦膠質(zhì)瘤和小鼠腫瘤的血管生成［19-20］，并抑制小鼠乳腺癌和黑色素瘤的生長［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性ISM分子通過激活caspase-8來誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡，而膜結(jié)合型ISM則通過激活黏著斑激酶促進血管內(nèi)皮細胞的存活和遷移［22］。筆者通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，ISM1在乳腺癌組織中的表達水平顯著下調(diào)，且其表達水平與乳腺癌患者病理分期有關(guān)。最近有文獻報道ISM1是NODAL信號通路的抑制劑［17］。已有研究表明NODAL通路與乳腺癌的進展相關(guān)，NODAL可通過激活ERK信號而調(diào)控c-myc和P27蛋白水平，最終導(dǎo)致腫瘤形成［23］。

表觀遺傳調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化是較早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾之一，正常組織中分散存在的CpG通常被甲基化，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（如啟動子）的CpG島則呈低甲基化［24］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)CpG島的甲基化可招募特異性甲基化結(jié)合蛋白，引起DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的改變，從而抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致多種信號通路以及細胞周期、凋亡、DNA損傷和免疫識別等改變。異常DNA甲基化與腫瘤發(fā)生有關(guān)，有研究報道，卵巢癌和乳腺癌患者中抑癌基因RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）由于其啟動子呈高甲基化而使其表達受抑［25］，DNA損傷修復(fù)基因谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）啟動子區(qū)域甲基化異?？煽s短肝癌患者生存期［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中ISM1啟動子的甲基化水平明顯增強，這與Suman等［27］的研究結(jié)果一致，提示乳腺癌患者中ISM1水平下調(diào)除了受miR-1307-3p的直接調(diào)控外，還可能與其啟動子甲基化有關(guān)，miR-1307-3p是否涉入其中機制，有待進一步深入研究。

綜上所述，miR-1307-3p可通過靶向ISM1而促進乳腺癌細胞增殖和遷移，其中可能涉及ISM1啟動子的甲基化、NODAL和ERK信號通路的激活等過程，本研究為明確乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制提供了新思路。