不同管理方式下秋季刺參養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)分析

王玉龍，林青，孫亞慧，王文琳，張津源，周瑋

（1.大連海洋大學(xué),水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧輕工職業(yè)學(xué)校，遼寧 大連 116100；3.大連?？h(huán)境監(jiān)測(cè)科技有限公司，遼寧 大連 116000）

刺參（Apostichopus japonicus）營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，已經(jīng)成為遼寧和山東等地的重要養(yǎng)殖對(duì)象之一[1-3]。2018 年全國(guó)海參產(chǎn)量約1.74 萬(wàn)t，養(yǎng)殖面積達(dá)到2.38 萬(wàn)hm2[4]。刺參多以池塘養(yǎng)殖為主。為打破制約刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，近年來(lái)大力推廣微孔曝氣裝置，輔助調(diào)控水質(zhì)取得了很好的效果。如快速增氧和去除底泥中有機(jī)質(zhì)等，但在使用過(guò)程中存在易堵塞和維護(hù)費(fèi)用高的缺點(diǎn)[5,6]。本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了養(yǎng)水機(jī)輔助水質(zhì)調(diào)控設(shè)備，在實(shí)際調(diào)控水質(zhì)中較于前兩種方式具一定優(yōu)勢(shì)[7-9]。

在生產(chǎn)中，可通過(guò)換水和水質(zhì)調(diào)控設(shè)備輔助保持較好養(yǎng)殖水質(zhì)，但環(huán)境中微生物在養(yǎng)殖池塘中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)、改善水質(zhì)環(huán)境以及刺參健康中起到了關(guān)鍵作用[10]。如假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）、假單胞菌（Pseudoalteromonas）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等都可使刺參患病[11-13]。而枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）等，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)的改善、提高養(yǎng)殖生物的非特異性免疫酶活性以及促進(jìn)養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)等都有明顯的作用[14-16]。秋季是刺參重要的生長(zhǎng)期，養(yǎng)殖環(huán)境的變化會(huì)對(duì)刺參的生長(zhǎng)有一定的影響。因此，對(duì)秋季刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義。

傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法存在一定局限性，無(wú)法滿(mǎn)足細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究的需要[17,18]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，是研究環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的重要手段[19,20]。目前對(duì)刺參池塘養(yǎng)殖中菌群結(jié)構(gòu)的研究，多利用DGGE 指紋圖譜技術(shù)[21,22]，其存在反應(yīng)優(yōu)勢(shì)菌信息少和操作繁瑣等問(wèn)題，而利用16S rDNA 高通量技術(shù)研究刺參養(yǎng)殖池塘的菌群結(jié)構(gòu)，則應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯[10]。本研究利用該技術(shù)研究了自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機(jī)3 種水質(zhì)管理方式下，參池環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)，以期為參池管理方式的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在大連市青堆子海域（N39.78°,E123.32°）的自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機(jī)池塘3 種海參養(yǎng)殖池中進(jìn)行。試驗(yàn)池均為矩形，面積都為5.1 hm2，池塘內(nèi)南深北淺，泥沙池底。實(shí)驗(yàn)期間各池塘不投餌和藥，統(tǒng)一管理。

養(yǎng)水機(jī)是本研究團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的新型水質(zhì)調(diào)控裝置（專(zhuān)利號(hào)：ZL200610077526.5）見(jiàn)圖1。其工作原理是通過(guò)進(jìn)水管道把池塘表層溶氧量相對(duì)較高的水引入到底層動(dòng)力泵，通過(guò)動(dòng)力泵把表層高溶氧量的水射入底層水體中，實(shí)現(xiàn)表底層水體強(qiáng)制交換，使得養(yǎng)殖池塘水體的流動(dòng)加快，并增加底層水體的溶氧量。此外，水體的強(qiáng)制交換過(guò)程有利于養(yǎng)殖池塘水體表底層的混合均勻，對(duì)于養(yǎng)殖池塘水體會(huì)出現(xiàn)的溫度和鹽度的分層具有一定的破壞作用，可以降低因水體分層造成養(yǎng)殖池塘底層水體缺氧現(xiàn)象的發(fā)生。養(yǎng)水機(jī)位于池塘進(jìn)水口最低處，水泵功率750 W，噴頭出水量為12 m3/h，每天21:00—次日9:00 工作12 h。

圖1 養(yǎng)水機(jī)模擬圖Fig.1 Diagram of a water quality regulator

微孔曝氣主要由供氣裝置、氣體傳輸管道和微孔曝氣管三部分組成。其工作原理是將空氣壓縮后通過(guò)安裝在池底的曝氣管，以微氣泡的形式向水中擴(kuò)散。微孔曝氣設(shè)備在池塘水體缺氧時(shí)開(kāi)啟，如陰雨天和夏季高溫期適當(dāng)增加開(kāi)機(jī)時(shí)間。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

2017 年11 月按照《國(guó)家海洋調(diào)查規(guī)范》（GB/T12763）的方法采集三種實(shí)驗(yàn)池塘水樣和泥樣，樣品標(biāo)記信息見(jiàn)表1。樣品立即放入-80℃液氮冷凍后，再用干冰冷凍運(yùn)送到北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)定。具體的樣品采集步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)郭超等[23]。每個(gè)樣品采集點(diǎn)采集兩個(gè)平行樣品。

表1 樣品標(biāo)記信息Tab.1 Labels of the samples

1.2.2 樣品DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

用CTAB 法提取樣本DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，確保取得樣品DNA 的完整性。條帶清晰完整無(wú)拖尾則視為采集的樣品質(zhì)量合格。使用NanoPhotometerClassic Launched（IMPLEN,GER）測(cè)定其純度，提取成功樣品的DNA 保存于-20℃下備用。

應(yīng)用含有Illumina 接頭和barcode 序列的引物341F-806R（Michelsen C F），擴(kuò)增樣品中DNA 的16S rRNA 基因的V3～V4 可變區(qū)。最后應(yīng)用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)完成序列測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

首先，處理獲得的原始序列，保留有效序列。接著使用FLASH 和QIIME[24,25]軟件將序列拼接為tags，然后對(duì)tags 進(jìn)行聚類(lèi)。根據(jù)Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。最后，計(jì)算各個(gè)樣品的細(xì)菌群落相對(duì)豐度。應(yīng)用PAST 軟件[24]計(jì)算6 個(gè)樣品中的細(xì)菌群落的α-多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落分類(lèi)學(xué)注釋

由圖2 可知，6 個(gè)樣品中總tags 平均值為81 111，可分類(lèi)的tags 平均值為70 794，無(wú)法分類(lèi)的tags 平均值為2，非沉余tags 平均值為10 315，運(yùn)算分類(lèi)單元平均值為926。

圖2 三種刺參池塘水體和底泥微生物群落高通量測(cè)序得到的序列數(shù)目及運(yùn)算分類(lèi)單元數(shù)目Fig.2 The number of sequences of the microbial communities and the number of operational taxa in the waters and sediments in the three sea cucumber culture ponds by high-throughput sequencing

在養(yǎng)水機(jī)池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出47 個(gè)門(mén)、100 個(gè)綱、448 個(gè)屬和56 個(gè)門(mén)、107 個(gè)綱、362 個(gè)屬的細(xì)菌。微孔曝氣池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出44 個(gè)門(mén)、127 個(gè)綱、386 個(gè)屬和60 個(gè)門(mén)、128 個(gè)綱、450 個(gè)屬的細(xì)菌。自然納潮池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出44 個(gè)門(mén)、98 個(gè)綱、398 個(gè)屬和55 個(gè)門(mén)、107個(gè)綱、440 個(gè)屬的細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

三種刺參養(yǎng)殖池塘水體和底泥菌群結(jié)構(gòu)特征見(jiàn)圖3。由圖3 可知：在門(mén)水平上，三種池塘6 個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前10 的門(mén)（圖3-a）分別為：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinocteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）。其占比為92.96%～99.05%。三種池塘底泥和水體中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)都是變形菌門(mén)，相對(duì)豐富度占55.86%～70.86%。

圖3 不同水質(zhì)調(diào)控方式下參池養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Characteristics of bacterial flora in sea cucumber culture ponds under different water quality regulation methods

在綱水平上，6 個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前10的綱（圖3-b）占比67.22%～92.76%。三種池塘底泥和水體中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)都是變形菌門(mén)，相對(duì)豐富度占比55.86%～70.86%。在水樣中三種池塘的Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 都是占比前兩位的優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度占比42.13%～63.45%。三種池塘的底泥樣品中Gammaproteobacteria 和Deltaproteobacteria 都是占比前兩位的優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度占38.54%～50.56%。

在屬水平上，6 個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前30的屬（圖3-c）占比15.16%～47.04%。在6 個(gè)樣品中各自的第一優(yōu)勢(shì)菌屬有所不同，養(yǎng)水機(jī)池塘水樣中未確定（unidentified）的_Chloroplast（相對(duì)豐度為7.37%），微孔曝氣和自然納潮池塘是Lentibacter（相對(duì)豐度為13.17%和7.70%）。養(yǎng)水機(jī)池塘底泥樣品中是Desulfobulbus（相對(duì)豐度分別為1.94%），微孔曝氣和自然納潮池塘是Sulfurovum（相對(duì)豐度分別為5.84%和4.88%）。

2.3 菌群多樣性

2.3.1 α-多樣性分析

6 個(gè)樣品的文庫(kù)覆蓋率均大于0.970，說(shuō)明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較高的可信度。三種不同池塘底泥和水體樣本細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)值見(jiàn)表2。由表2 可知，養(yǎng)水機(jī)池塘水樣中Chao、AC、Shannon 和Simpson 指數(shù)最高，微孔曝氣池塘水樣的Chao、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)最低。

表2 不同水質(zhì)調(diào)控方式下池塘細(xì)菌的高通量測(cè)序結(jié)果Tab.2 High throughput sequencing results of bacteria in sea cucumber culture ponds under different water quality control methods

養(yǎng)水機(jī)池塘泥樣中Chao 和ACE 指數(shù)最低。自然納潮池塘的Shannon 指數(shù)最低。微孔曝氣池塘的Chao、ACE 和Shannon 指數(shù)都最高，而Simpson 指數(shù)最低。三種池塘的Simpson 指數(shù)一致。

隨著隨機(jī)抽取的序列總數(shù)的增加，Chao1、observed species 和Shannon 曲線圖（圖4），各個(gè)樣品的三種曲線到達(dá)60 000 這個(gè)臨界值時(shí)都趨于平緩，表示測(cè)序結(jié)果已經(jīng)可以反映當(dāng)前樣品所包含的多樣性。繼續(xù)增加測(cè)序深度已不能檢測(cè)到數(shù)量較多且尚未發(fā)現(xiàn)的新類(lèi)型OUT。

圖4 OUT 數(shù)目的稀釋曲線圖Fig.4 Dilution curve of OUT number

2.3.2 β-多樣性分析

由圖5 可知，第1 主坐標(biāo)（PCoA1）、第2 主坐標(biāo)（PCoA2）和第3 主坐標(biāo)（PCoA3）的貢獻(xiàn)率分別為17.54%、12.28%和6.61%，三者累計(jì)貢獻(xiàn)率為36.43%。三種池塘水樣與底泥樣品的距離相對(duì)較遠(yuǎn)。水樣的樣品中微孔曝氣池塘和自然納潮池塘距離較近，而養(yǎng)水機(jī)池塘與其他兩種池塘相聚較遠(yuǎn)，但離泥樣的距離比其他兩種池塘要近。在底泥樣品中養(yǎng)水機(jī)池塘與自然納潮池塘較近，這兩種池塘較微孔曝氣池塘較遠(yuǎn)。這表明在水樣中微孔曝氣池塘和自然納潮池塘菌群結(jié)構(gòu)差異性小，相似度高。而在底泥樣品中養(yǎng)水機(jī)池塘和自然納潮池塘菌群結(jié)構(gòu)差異性小，相似度高。

圖5 UniFrac PCoA 分析的樣品三維排序圖Fig.5 3 D ordered map of Sample dilution curve by UniFrac PCoA analysis

3 討論

3.1 不同水質(zhì)調(diào)控方式下參池環(huán)境中菌群多樣性

Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)可用于評(píng)價(jià)細(xì)菌群落多樣性、物種豐富度和均勻度。根據(jù)保險(xiǎn)假說(shuō)（Insurance hypothesis），高生物多樣性有利于提高生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[27]。表2 中三種池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)都是底泥中高于水中，這與閆法軍等[28]和Zhao 等[29]的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)楹Ｑ蟪练e物表層環(huán)境微生物量約占到海洋微生物總量的70%[30]。三種池塘水環(huán)境中，養(yǎng)水機(jī)池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)均最高，微孔曝氣池塘最低。這是因?yàn)轲B(yǎng)水機(jī)池塘長(zhǎng)時(shí)間的水體循環(huán)，使得池塘內(nèi)各水層間的浮游植物量和菌群分布相較于其他兩個(gè)池塘更為均勻[31,32]。浮游植物光合作用產(chǎn)生的有機(jī)質(zhì)會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的大量繁殖[31]。其次，養(yǎng)水機(jī)長(zhǎng)時(shí)間的工作使水體擾動(dòng)，底泥中的細(xì)菌隨著再懸浮顆粒進(jìn)入水體。圖5 的UniFrac PCoA 分析中表明，養(yǎng)水機(jī)池塘水中樣品離底泥樣品比其他兩種池塘更近，可能與這個(gè)原因有關(guān)。雖然，微孔曝氣池塘同樣會(huì)造成水體擾動(dòng)，但其在實(shí)際生產(chǎn)使用主要是為了快速給池塘增氧，開(kāi)機(jī)時(shí)間相對(duì)較短，不會(huì)產(chǎn)生像養(yǎng)水機(jī)池塘那樣明顯的效果。高溶氧量會(huì)抑制厭氧細(xì)菌[10]。但三種池塘底泥中的結(jié)果反之。有研究表明，有機(jī)物含量對(duì)環(huán)境中菌群的多樣性和豐度有正相關(guān)關(guān)系[30,34-36]。因此，養(yǎng)水機(jī)池塘水環(huán)境中菌群多樣性最高。這對(duì)于水體較淺易受外界環(huán)境影響的刺參池塘，有利于養(yǎng)殖水體環(huán)境的穩(wěn)定，可以一定程度抑制病原菌的大量繁殖，有利于刺參的存活。

3.2 不同水質(zhì)調(diào)控方式參池環(huán)境中菌群特征

近年來(lái)，對(duì)刺參池塘環(huán)境中菌群群落組成已有報(bào)道。譚八梅等[37]、丁斯予等[38]和Zhao 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，秋季刺養(yǎng)殖池塘水體和底泥中，第一和第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，前者為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。這與本研究的3 種刺參養(yǎng)殖池塘的水體和底泥中菌群組成結(jié)果相似，其中，三種池塘的第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)一致，為變形菌門(mén)（相對(duì)豐度為55.86%以上）。由圖3-a 可知，在刺參養(yǎng)水機(jī)池塘水體的第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)，其他兩種池塘都為擬桿菌門(mén)。這可能是因?yàn)樗疁氐慕档褪沟灭B(yǎng)水機(jī)池塘水體中厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度變大[36]。微生物在分解底泥中有機(jī)質(zhì)時(shí)釋放熱量會(huì)使間隙水水溫升高8.5℃[39,40]。夜間養(yǎng)水機(jī)設(shè)備工作時(shí)，將表層的低溫水與底層高溫水交換，使得池塘內(nèi)底層水體溫度加速下降。而芽孢桿菌綱內(nèi)的物種具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性[41]。因此養(yǎng)水機(jī)池塘內(nèi)第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有別于其他兩種池塘。董春光等[14]發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)的枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體中的NO3--N 和NO2--N 有一定的去除作用，提升養(yǎng)殖水質(zhì)的同時(shí)促進(jìn)了刺參的生長(zhǎng)。養(yǎng)水機(jī)池塘水體環(huán)境在一定程度上要優(yōu)于其他兩種池塘。

在養(yǎng)水機(jī)、微孔曝氣和自然納潮3 種水質(zhì)調(diào)控方式下，刺參養(yǎng)殖池塘底泥中，第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為擬桿菌門(mén)、綠灣菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。養(yǎng)水機(jī)池塘和微孔曝氣池塘與其他的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵黾铀w溶氧量時(shí)對(duì)水體產(chǎn)生擾動(dòng)有關(guān)。姚麗平[42]研究發(fā)現(xiàn)，不同曝氣強(qiáng)度影響底泥中細(xì)菌結(jié)構(gòu)分布和其在物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中的作用。如流速為0.247 m/s、對(duì)應(yīng)溶氧為6.18 mg/L、雷諾數(shù)為1 311 的曝氣條件下，以厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群，且對(duì)硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。自然納潮池塘厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）為主要優(yōu)勢(shì)菌綱，其相對(duì)豐度分別為7.07%和3.83%（圖3-b）。孫永旭等[43]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧組花鱸（Lateolabrax maculatus）腸道菌群變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降，而梭菌綱和擬桿菌綱明顯上升。自然納潮池塘相較于其他兩種池塘，細(xì)菌豐度變化趨勢(shì)與缺氧組花鱸腸道菌群豐度一致，說(shuō)明自然納潮池塘的溶氧要低于其他兩種池塘。三種池塘中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)、綱和屬是一致的（圖3），其差異主要表現(xiàn)在各優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度有所不同。這可能是養(yǎng)殖池塘內(nèi)環(huán)境不同所致[44,45]。說(shuō)明刺參養(yǎng)殖池塘管理方式的不同，不能改變養(yǎng)殖環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，但可以改變優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度。