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    miR-103對牙髓干細胞增殖及其向成牙本質(zhì)細胞分化的影響

    2022-02-24 03:14:18李鳳月齊洪光于登臣袁佳運侯寶華
    實用口腔醫(yī)學雜志 2022年1期
    關(guān)鍵詞:茜素牙本質(zhì)牙髓

    李鳳月 齊洪光 于登臣 袁佳運 侯寶華

    牙髓再生、自體牙再造等再生醫(yī)學研究在牙體牙髓病領(lǐng)域中得到了廣泛關(guān)注,而作為“種子細胞”的牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)成為近年來的研究熱點[1-2]。目前,對DPSCs增殖、分化等生物學特性的調(diào)控機制尚不完全清楚,牙體牙髓領(lǐng)域的再生醫(yī)學研究仍處于初級階段[3]。因此,深入研究DPSCs的增殖與分化等生物學行為的調(diào)控機制具有重要意義。近年來, miR-103對DPSCs的作用尚不清楚。本研究通過從成人第三磨牙中分離培養(yǎng)DPSCs,利用轉(zhuǎn)染技術(shù)在DPSCs中過表達及降低miR-103的含量,繼而檢測miR-103對DPSCs增殖及分化的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與儀器

    澳洲胎牛血清、低糖的DMEM細胞培養(yǎng)基、I型膠原及雙抗等細胞培養(yǎng)試劑(Gibco公司,美國);轉(zhuǎn)染試劑lipo2000(Invitrogen公司,美國);miRNA核苷酸序列(南京舟達公司);q-PCR試劑套裝(RNA的提純、反轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒)(Takara公司,日本);q-PCR引物(上海生工生物公司);CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天公司);Runx2和Osx等抗體(Abcam公司,英國);茜素紅、地塞米松、維生素C和磷酸甘油(Sigma公司,美國);細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及離心管(Corning公司,美國); 實時熒光定量PCR儀(ABI7500fast,Applied Biosystems公司,美國);酶標儀(SPS5845,上海沛歐分析儀器有限公司);顯微鏡(cx21fs1,Olympus公司,日本);電泳儀(天能EPS600, 上海天能公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 從成人第三磨牙中分離DPSCs,方法如下:所用牙齒均來自因阻生或因正畸治療需要而拔出的健康第三磨牙。第三磨牙拔出后進行徹底消毒,用含有青霉素及鏈霉素的清洗液浸泡后用環(huán)鉆劈開,無菌條件下取出牙髓組織,并將上述組織修剪成約1 mm3的組織塊,用I型膠原酶完全覆蓋消化組織,短暫反應后,將消化后的組織塊置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),將培養(yǎng)瓶置于常規(guī)孵箱中培養(yǎng),隔天置換培養(yǎng)基,待DPSCs從組織塊中爬出。待細胞融合率在70%左右時進行細胞傳代,取3~8 代的細胞用于實驗[4]。

    利用lipo2000將公司合成的80 nmol/L的miRNA相關(guān)核苷酸序列轉(zhuǎn)染進DPSCs。本實驗根據(jù)轉(zhuǎn)染入細胞的核苷酸序列不同,將細胞分為對照組(Control)、miRNA陰性對照組(miR-NC)、miR-103過表達組(miR-mimic)和miR-103降低表達組(anti-miR)[5]。

    1.2.2 茜素紅染色 完成細胞轉(zhuǎn)染后,利用75%乙醇固定培養(yǎng)皿中的DPSCs,利用雙蒸水沖洗細胞3 次,每孔加入40 mmol/L的茜素紅染料浸沒,染色10 min后清洗染料,并再次利用雙蒸水緩慢沖洗培養(yǎng)皿,在培養(yǎng)皿中加入緩沖液后繼續(xù)室溫孵育, 30 min后觀察紅色的礦化結(jié)節(jié)。采用梯度稀釋法制作茜素紅-吸光度標準曲線,進行半定量檢測[6]。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié) 果

    2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測

    在利用合成的核苷酸轉(zhuǎn)染細胞后,利用q-PCR技術(shù)檢測每組細胞miR-103的含量變化,驗證轉(zhuǎn)染效率。和miR-NC 相比,miR-mimic組miR-103含量大幅增加(P<0.05),而anti-miR細胞miR-103含量顯著下降(P<0.05);和Control相比,miR-NC組細胞內(nèi)miR-103含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05)(圖 1)。

    圖 1 q-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞內(nèi)miR-103的含量 圖 2 CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力

    2.2 miR-103抑制DPSCs的增殖

    驗證轉(zhuǎn)染效率后,利用CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力如圖 2,和miR-NC 相比,miR-mimic組DPSCs的增殖能力減弱(P<0.05),而anti-miR組DPSCs的增殖能力增強(P<0.05);和Control相比,miR-NC組DPSCs的增殖能力未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

    2.3 miR-103降低Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量

    利用q-PCR技術(shù)檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化如圖 3,和miR-NC 相比,miR-mimic組Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量減少(P<0.05),而anti-miR細胞Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量增加(P<0.05);和Control相比,miR-NC組細胞內(nèi)Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

    圖 3 q-PCR技術(shù)檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化

    2.4 miR-103降低Runx2和Osx蛋白的表達

    利用Western blot技術(shù)檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達如圖 4,和miR-NC 相比,miR-mimic組Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達減少(P<0.05),而anti-miR細胞Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達增加(P<0.05);和Control相比,miR-NC組細胞內(nèi)Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

    圖 4 Western blot技術(shù)檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達

    2.5 miR-103抑制DPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成

    利用茜素紅染色的方法檢測各組細胞的礦化能力如圖 5,和miR-NC相比, miR-mimic組礦化能力減弱(P<0.05),而anti-miR組礦化能力增強(P<0.05);和Control相比,miR-NC組礦化能力未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

    圖 5 茜素紅檢測各組細胞的礦化能力

    3 討 論

    牙髓牙體疾病在口腔疾病中發(fā)病率較高,而就診的患者中有很大一部分的牙體牙髓已經(jīng)發(fā)生了不可逆的損傷,往往只能通過去除病變的牙體及牙髓的手段治療,達到癥狀緩解及恢復功能的目的[7]。而隨著組織工程技術(shù)的飛快發(fā)展,再生醫(yī)學在牙體牙髓研究領(lǐng)域也成為研究熱點。DPSCs是極具臨床應用潛力的間充質(zhì)干細胞,當牙髓組織受到損傷后DPSCs根據(jù)損傷情況,在精密的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下分化,修復損傷的牙髓組織或牙本質(zhì)[8]。而DPSCs增殖與分化等生物學行為的調(diào)控機制非常復雜,尚未完全闡明。

    文獻綜述后發(fā)現(xiàn)miR-103在骨髓間充質(zhì)干細胞分化調(diào)控及成骨細胞增殖調(diào)控中具有重要作用[5,9],為驗證miR-103對DPSCs增殖和分化的調(diào)控作用,研究利用細胞轉(zhuǎn)染核苷酸片段的技術(shù)體外成功過表達和降低表達miR-103。隨后發(fā)現(xiàn)過表達miR-103抑制DPSCs增殖,這與之前學者報道一致。Sun等[5]證實miR-103能夠通過作用于鈣離子通道關(guān)鍵蛋白Cav1.2抑制成骨細胞的增殖。Liao等[10]發(fā)現(xiàn)miR-103通過直接靶向周期相關(guān)蛋白CCNE1和CDK2抑制小鼠腸道細胞的增殖。還有學者證明miR-103在乳腺癌細胞中高表達,并在其增殖等生物學行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。

    隨后還驗證了miR-103對DPSCs內(nèi)Runx2, Osx和ALP等分化指標表達的影響。Osx也是骨形成調(diào)控過程中不可缺少的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,缺少Osx會引起DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化障礙[6]。在本實驗中,發(fā)現(xiàn)miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化。為了進一步驗證miR-103抑制DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化,利用茜素紅染色檢測了miR-103對DPSCs礦化能力的影響,發(fā)現(xiàn)miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化,并最終抑制了DPSCs的礦化作用。這和之前報道一致,Zuo等[9]發(fā)現(xiàn)miR-103能夠通過靶向作用Runx2在細胞水平和動物水平抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化和礦化能力。

    綜上所述,miR-103能夠抑制DPSCs的增殖能力,并抑制DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化。本實驗探討了miR-103對DPSCs增殖和分化的影響,但miR-103對DPSCs增殖和分化的調(diào)控機制仍有待進一步研究與探索。

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