山茱萸多糖對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的機制

聶志勇，李守淼，王衛(wèi)杰，李煥煥，袁冬冬

(安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 安陽 455000)

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥具有治療胃癌的作用，且在提高胃癌患者免疫力及改善生活質(zhì)量等方面具有一定優(yōu)勢[1-2]。如紅景天苷明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖并通過Bcl/Bax信號通路誘導(dǎo)其凋亡[3]。紫檀芪可能通過ROS激活線粒體途徑，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[4]。山茱萸多糖是山茱萸的主要有效成分，其具有抗氧化、抗衰老、增強免疫功能及抗腫瘤等作用[5]。研究表明，山茱萸多糖可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞增殖[6-7]。然而山茱萸多糖是否對胃癌有抗癌作用及其機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在癌癥進展過程中起著至關(guān)重要的作用，可作為胃癌診斷，治療及評估預(yù)后等的生物靶點[8]。研究報道，lncRNAELF3-AS1可促進體外膀胱癌細(xì)胞的活力和遷移，并促進體內(nèi)異種移植腫瘤的生長[9]。沉默lncRNA ELF3-AS1可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[10]。以上研究表明，lncRNA ELF3-AS1可能在癌癥中起促癌作用。而lncRNA ELF3-AS1在胃癌中的作用及其對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。本實驗旨在研究山茱萸多糖對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機制是否與lncRNA ELF3-AS1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞株AGS購自上海澳音生物科技有限公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自上海雅吉生物科技有限公司；山茱萸多糖購自上海益本生物醫(yī)藥科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.2 裸鼠荷瘤實驗BALB/C裸小鼠購自南京君科生物工程有限公司(動物合格證號；閔20190013)，取對數(shù)生長期細(xì)胞AGS，消化制成單細(xì)胞懸液后，于每只裸鼠右后肢皮下接種2.0×106個細(xì)胞；所有裸鼠1周后皮下出現(xiàn)>5 mm的結(jié)節(jié)時表明移植瘤建立成功。將接種成功后的裸鼠隨機分為對照組、山茱萸多糖低、中、高劑量組，每組6只，按分組給藥，對照組每天給予蒸餾水灌胃，山茱萸多糖低、中、高劑量組分別按12.5、25、50 g·mg-1劑量給藥，每組每天灌胃1次，連續(xù)給藥10 d；在d 14、21、28時分別處死部分小鼠，剝離腫瘤組織，檢測腫瘤體積。取28 d后小鼠腫瘤組織參照“1.5”中方法檢測腫瘤組織中Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

1.3 TUNEL法檢測裸鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)將裸鼠移植瘤組織進行固定，經(jīng)石蠟包埋、切片后用二甲苯脫蠟，然后用胰蛋白酶消化，加入TUNEL反應(yīng)液37 ℃孵育1 h，加入過氧化物酶抗體37 ℃孵育30 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫孵育30 min，然后封片，烘干，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核染色呈棕黃色顆粒的為凋亡陽性細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率/%=(染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4 細(xì)胞處理與分組胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞AGS用RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞AGS，分別用12.5、25、50 g·L-1的山茱萸多糖處理AGS細(xì)胞，作為山茱萸多糖低、中、高劑量組，不作處理的AGS細(xì)胞作為對照組；將si-NC、si-ELF3-AS1轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中，記為si-NC組、si-ELF3-AS1組；將pcDNA、pcDNA-ELF3-AS1轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞后用50 g·L-1的山茱萸多糖處理，記為山茱萸多糖+pcDNA組、山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1組。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率取培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，每孔20 μL MTT溶液，孵育4 h后加入150 μL DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處檢測吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率/%=1-實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，用結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入Ki-67、Bcl-2、Bax的一抗，4 ℃孵育過夜；加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算目的條帶蛋白表達(dá)水平。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA ELF3-AS1表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。lncRNA ELF3-AS1上游引物序列：5′-TGAAGTCATCACGAACCGC-3′，下游引物序列：5′-GGAGCCCCAAGTTAATGCG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′，下游引物序列：5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸多糖對胃癌AGS細(xì)胞裸鼠移植瘤體積變化的影響不同劑量山茱萸多糖處理的裸鼠14 d、21 d、28 d后，與對照組比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積均明顯降低(P<0.05)，見Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Changes in volume of transplanted tumors in each group1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Tab 1 Effect of cornus officinalis polysaccharides on volume changes of gastric cancer AGS cell xenograft tumor in nude mice

Fig 2 Effectof cornus officinalis polysaccharides on tumor cell apoptosis in nude micedetected by TUNEL method1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.2 TUNEL法檢測山茱萸多糖對裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響不同劑量山茱萸多糖處理的裸鼠28 d后，與對照組[(9.22±0.96)%]比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)[(29.55±2.56)%、(46.33±4.28%)、(68.26±5.28)%]升高(P<0.05)，見Fig 2。

2.3 山茱萸多糖對裸鼠腫瘤組織增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組裸鼠腫瘤組織中Ki-67、Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Proliferation and apoptosis-related protein expression1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.4 山茱萸多糖對胃癌AGS細(xì)胞增殖及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細(xì)胞增殖抑制率[(19.04±1.67)%、(32.14±2.96)%、(51.36±3.65)%vs(0.00±0.00)%]升高，Ki-67蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Ki-67 protein expression1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.5 山茱萸多糖對胃癌AGS細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細(xì)胞凋亡率[(13.17±1.13)%、(20.37±2.02)%、(29.56±2.18)%vs(7.64±0.52)%]升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見Fig 5。

2.6 lncRNA ELF3-AS1在胃癌AGS細(xì)胞中的表達(dá)與GES-1比較，AGS細(xì)胞中ELF3-AS1表達(dá)水平(3.55±0.24vs1.00±0.07)升高(P<0.05)。

2.7 山茱萸多糖對胃癌AGS細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ELF3-AS1表達(dá)的影響與對照組(1.00±0.06)比較，山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細(xì)胞中ELF3-AS1表達(dá)水平(0.77±0.05、0.63±0.04、0.41±0.04)降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.8 抑制lncRNA ELF3-AS1表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響與si-NC組比較，si-ELF3-AS1組ELF3-AS1表達(dá)水平降低，細(xì)胞抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見Fig 6，Tab 2。

Tab2 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS

2.9 lncRNA ELF3-AS1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了山茱萸多糖(50 g·L-1)對胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用與山茱萸多糖+pcDNA組比較，山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1組ELF3-AS1表達(dá)水平升高，細(xì)胞抑制率降低，細(xì)胞凋亡率降低，Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見Fig 7，Tab 3。

Fig 5 Effect of cornus officinalis polysaccharides on apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Apoptosis-related protein expression;B:Apoptosis flow cytometry；1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Fig 6 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis

Tab3 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

Fig 7 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis；1：cornus officinalis polysaccharide+pcDNA group；2：cornus officinalis polysaccharide+pcDNA-ELF3-AS1 group

3 討論

中藥治療胃癌是我國獨特的治療手段，由于目前中藥在胃癌中治療的作用機制尚未完全揭示，使得中藥治療在臨床應(yīng)用中仍存在較大局限性[11-12]。因此，深入研究中醫(yī)藥治療胃癌的分子機制有助于其臨床治療。研究報道山茱萸多糖可抑制人宮頸癌HeLa及HepG2細(xì)胞的增殖，并促進細(xì)胞凋亡[13-14]。而山茱萸多糖對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。本實驗建立皮下移植瘤裸鼠模型，用不同劑量的山茱萸多糖對裸鼠進行灌胃處理，結(jié)果顯示，裸鼠體內(nèi)移植瘤體積降低，裸鼠組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，且Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高；說明山茱萸多糖可抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長。為進一步證明山茱萸多糖在體外的作用，用不同濃度山茱萸多糖處理胃癌細(xì)胞AGS后，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性；表明山茱萸多糖可劑量依賴的抑制胃癌細(xì)胞增殖，且可促進細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明山茱萸多糖在體內(nèi)體外均可抑制胃癌細(xì)胞的生長。

研究報道lncRNA ELF3-AS1可促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[15]；促進骨肉瘤細(xì)胞的增殖[16]。本實驗結(jié)果顯示，lncRNA ELF3-AS1在胃癌細(xì)胞AGS中同樣高表達(dá)；抑制lncRNA ELF3-AS1表達(dá)后，AGS細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高；說明抑制lncRNA ELF3-AS1表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡。此外，本實驗結(jié)果顯示，山茱萸多糖可降低胃癌細(xì)胞AGS中l(wèi)ncRNA ELF3-AS1表達(dá)水平；而lncRNA ELF3-AS1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了山茱萸多糖對胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

綜上所述，山茱萸多糖可能通過下調(diào)lncRNA ELF3-AS1抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖，促進AGS細(xì)胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖同樣對胃癌具有抑癌作用，且可能通過調(diào)控ELF3-AS1作用。