非諾貝特對干燥綜合征小鼠Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)作用△

郭星藝 粘 紅 王 穎 李 娜 黨維鈺 魏瑞華

干燥綜合征(SS)相關(guān)干眼是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其病理特征為大量淋巴細胞浸潤淚腺，導(dǎo)致腺體分泌功能障礙，是較為嚴重和難治的干眼類型[1]。傳統(tǒng)理論認為，Th1/Th2免疫平衡失調(diào)及其導(dǎo)致的細胞因子復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)變化對SS相關(guān)干眼的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[2-4]。近年來研究指出，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)及抑制炎癥方面起著重要作用，與淚腺炎癥密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，其在SS患者外周血中比例降低，并且與炎癥指標如紅細胞沉降率等呈負相關(guān)[6]。非諾貝特是過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)激動劑，早期主要用于血脂異?；颊叩慕抵委焄7]，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其能夠在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫調(diào)控作用。研究表明，非諾貝特可通過降低結(jié)腸中干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-17的表達，抑制結(jié)腸炎動物模型炎癥反應(yīng)[8]，或通過上調(diào)小鼠脾臟中Foxp3和IL-10表達水平，減緩自身免疫性心肌炎進程[9]。但是其在SS相關(guān)干眼中的作用機制尚未完全明確。因此，本研究以SS相關(guān)干眼動物模型NOD小鼠為研究對象，通過喂養(yǎng)SS小鼠含非諾貝特的飼料，探究非諾貝特對SS相關(guān)干眼的療效和對Treg細胞的免疫調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級15周齡NOD/ShiLtJ雄性小鼠，體重約30 g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。實驗動物的飼養(yǎng)及操作符合國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》的規(guī)定，并獲得天津醫(yī)科大學(xué)動物管理及使用委員會的批準 (批文號：TJYY20201221032)。

1.1.2 主要試劑及儀器RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；熒光素鈉注射液(美國Alcon Laboratories公司)；抗小鼠CD4異硫氰酸熒光素(FITC)流式抗體、抗小鼠叉頭狀蛋白P3(Foxp3)巰基化藻紅蛋白(PE)流式抗體、抗小鼠CD16/32抗體(美國Biolegend公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(沈陽興齊眼藥股份有限公司);RNA提取試劑盒(美國EZBiocience公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、破膜固定試劑盒(美國Thermo公司)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)、LightCycler 480 PCR儀(瑞士Roche公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);裂隙燈照相系統(tǒng)(重慶康華公司)；酚紅棉線(天津晶明新技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組處理雄性NOD小鼠14只，采用完全隨機方法將小鼠隨機分為非諾貝特組和模型組，每組7只。非諾貝特組小鼠每天給予含0.3 g·kg-1非諾貝特(Abcam公司)的標準飼料(LAD3001M，南通特洛菲飼料科技有限公司)喂養(yǎng)，模型組小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)8周。

1.2.2 淚液分泌試驗于治療前及治療后4周、8周行淚液分泌試驗。用眼科顯微鑷夾酚紅棉線，置于小鼠下結(jié)膜囊中外1/3瞼結(jié)膜面，計時30 s，記錄變紅的酚紅棉線長度，實驗中避免鑷子造成角膜上皮損傷。計算雙眼讀數(shù)的平均值，重復(fù)3次。

1.2.3 角膜熒光素鈉染色評分于治療前及治療后4周、8周行角膜熒光素鈉染色評分。復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，使用移液器吸取1 μL 20 g·L-1熒光素鈉溶液滴入小鼠下方結(jié)膜囊內(nèi)。90 s后，在裂隙燈顯微鏡鈷藍濾光片下對角膜上皮損傷進行分級評分。將角膜劃分為4個象限，輕微點狀著染少于30個為1分；點狀著染多于30個為2分；彌散著染但未形成片狀為3分；片狀著染為4分。4個象限之和為角膜染色評分，總分上限為16分[10]。

1.2.4 淚腺組織病理學(xué)觀察治療后8周，麻醉處死，剪開小鼠眼外眥部與耳根下方的皮膚及皮下組織，鈍性分離淚腺。取出淚腺后，固定在體積分數(shù)10%福爾馬林液中，進行石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡觀察HE切片，使用ImageJ軟件測量淋巴細胞浸潤面積和淚腺總面積，計算浸潤面積百分比[11]。對同一淚腺標本3張非連續(xù)切片進行數(shù)據(jù)采集，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測淚腺中Foxp3、IL-10 mRNA相對表達量治療后8周，按照RNA提取試劑盒說明書提取小鼠淚腺總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模板，按照說明書進行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析淚腺中Foxp3、IL-10 mRNA相對表達量。其中，GAPDH引物序列：正向為5’-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’，反向為5’-GCGGCACGTCAGATCCA-3’； Foxp3引物序列：正向為5’-CCCTGCCCTTGACCTCAA-3’，反向為5’-GCCTCAGTCTCATGGTTTTGG-3’；IL-10引物序列：正向為5’-GATGCCCCAGGCAGAGAA-3’，反向為5’-CACCCAGGGAATTCAAATGC-3’。

1.2.6 流式細胞儀檢測小鼠脾臟中Treg細胞比例治療后8周，分離小鼠脾臟并研磨得到單個核細胞懸液，抗小鼠CD16/32抗體冰上孵育10 min，封閉細胞表面Fc受體，加入抗小鼠FITC-CD4抗體4 ℃避光孵育20 min，洗滌細胞，在破膜固定液中4 ℃避光過夜。第2天，加入抗小鼠PE-Foxp3抗體室溫避光孵育60 min。洗滌細胞，流式細胞儀檢測小鼠脾臟中Treg細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理與分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用Shapiro-Wilk檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，Levene檢驗方差齊性。兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠角膜熒光素鈉染色評分比較治療前模型組和非諾貝特組小鼠角膜均有熒光素鈉著染，角膜染色評分分別為(4.71±0.95)分和(4.86±0.69)分，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.753)。治療后4周、8周，模型組小鼠角膜熒光素鈉著染較明顯，可見片狀著色區(qū)，非諾貝特組小鼠角膜著染范圍明顯小于模型組(圖1)。治療后4周、8周，非諾貝特組小鼠角膜染色評分分別為(4.00±1.63)分和(4.43±1.51)分，明顯低于模型組的(7.43±1.90)分和(8.43±1.90)分，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003、0.001)。

2.2 兩組小鼠淚液分泌量比較治療前模型組和非諾貝特組小鼠淚液分泌量分別為(2.35±0.55)mm和(2.29±0.46)mm，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.831)。治療后4周、8周，非諾貝特組小鼠淚液分泌量分別為(4.40±1.47)mm和(5.47±0.87)mm，較模型組(2.66±0.72)mm和(2.71±0.76)mm均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、0.000)。

2.3 兩組小鼠淚腺炎癥浸潤面積比較淚腺HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠大面積淋巴細胞浸潤灶圍繞在腺管周圍，破壞了腺管、腺泡等結(jié)構(gòu)(圖2)。治療后8周，非諾貝特組小鼠淚腺淋巴細胞浸潤減少，部分淚腺腺管、腺泡結(jié)構(gòu)保留完整，浸潤面積百分比為(13.44±2.49)%，較模型組[(18.49±2.33)%]明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

2.4 兩組小鼠淚腺中Foxp3及IL-10 mRNA相對表達量比較實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，治療后8周，非諾貝特組小鼠淚腺中Foxp3及IL-10 mRNA相對表達量分別為1.53±0.35、1.61±0.51，明顯高于模型組的1.03±0.05、1.00±0.01，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002、0.008)。

2.5 兩組小鼠脾臟中Treg細胞比例的比較治療后8周，分離各組小鼠脾臟細胞，流式細胞儀檢測Treg細胞比例，結(jié)果顯示，非諾貝特組小鼠脾臟中Treg細胞比例為(8.25±1.13)%，明顯高于模型組的(5.89±1.31)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)(圖3)。

圖2 模型組(A)和非諾貝特組(B)小鼠淚腺切片HE染色 注：黑色箭頭示淚腺內(nèi)炎癥細胞浸潤。

圖3 模型組和非諾貝特組小鼠脾臟中Treg細胞比例

3 討論

目前，SS相關(guān)干眼的藥物治療效果有限，人工淚液僅能緩解癥狀不能根治干眼，具有抗炎作用的免疫抑制劑長期應(yīng)用有較大的副作用，如肝或腎功能損害、胃腸道不適及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等，因此，尋找安全有效的治療方法是眼科臨床亟待解決的問題[12-13]。非諾貝特屬于氯貝特類調(diào)脂藥，應(yīng)用于臨床已有半個多世紀，除了降血脂的作用外，還具有顯著的抗炎作用。近年來研究顯示[9,14-16]，在實驗性自身免疫性心肌炎、腦脊髓炎、1型糖尿病中，非諾貝特能夠有效抑制體內(nèi)的自身免疫反應(yīng)。Osada等[17]研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特可改善自身免疫性葡萄膜炎的臨床評分，緩解小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。但非諾貝特對SS相關(guān)干眼所致淚腺炎癥的作用尚未見報道。

NOD小鼠是理想的SS相關(guān)干眼模型小鼠，能夠較好地模擬人SS相關(guān)干眼的特點[18]。雄性小鼠可自發(fā)地產(chǎn)生干眼，在12～16周出現(xiàn)淚腺功能障礙，且隨著周齡增加癥狀加重[19]。雌性小鼠未表現(xiàn)出淚腺炎癥和分泌功能喪失，卻在16～20周出現(xiàn)嚴重的唾液腺浸潤，并伴有糖尿病表現(xiàn)[20]。雄性小鼠比雌性小鼠更容易發(fā)生淚腺炎癥、淚液減少和角膜炎癥，因此，本研究采用雄性NOD小鼠作為SS相關(guān)干眼模型鼠。

本研究中，我們通過給NOD小鼠喂養(yǎng)含或不含非諾貝特的飼料，首次探討了非諾貝特對SS相關(guān)干眼的作用。我們發(fā)現(xiàn)非諾貝特組小鼠淚液分泌量顯著增加，角膜熒光素鈉染色著色明顯減輕。與此臨床結(jié)果相一致的是，組織病理學(xué)切片也顯示淚腺組織中非諾貝特組小鼠淋巴細胞浸潤顯著減輕。有研究證實，用苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼小鼠模型局部使用非諾貝特滴眼后角膜上皮缺損面積明顯縮小，淚膜破裂時間增加[21]，這和本研究結(jié)果相似。

SS相關(guān)干眼是由多種因素導(dǎo)致的淚腺相對特異性自身免疫病，確切發(fā)病機制至今尚未完全明確。Treg細胞是一類特異表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3且具有免疫負性調(diào)節(jié)功能的CD4+T細胞，可通過細胞直接接觸及分泌抑制性細胞因子(主要為IL-10)等途徑發(fā)揮抗炎和維持自身免疫耐受的作用[22]。大量研究表明，NOD小鼠Treg細胞的數(shù)量和功能存在缺陷[23-26]。Lieberman等[27]通過過繼轉(zhuǎn)移實驗進一步證實，雄性NOD小鼠淚腺Treg細胞功能缺陷是導(dǎo)致其自身免疫性淚腺炎發(fā)生的主要原因。另外，研究發(fā)現(xiàn)淚腺中Treg細胞數(shù)量增多可有效改善干眼癥狀，增加杯狀細胞密度和角膜上皮完整性[28]，延緩自身免疫性淚腺炎的發(fā)展[29]。Zhou等[30]體外實驗證明，非諾貝特促進小鼠CD4+T細胞向Treg細胞的分化，本研究中非諾貝特治療顯著增加脾臟中Treg細胞比例，與報道結(jié)果相符。研究表明，與健康對照者相比，SS患者血清中IL-10顯著下降[31]。IL-10是發(fā)揮免疫抑制作用的主要細胞因子，主要由Treg細胞分泌。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非諾貝特組小鼠淚腺IL-10表達水平上升，提示局部淚腺組織中Treg細胞的免疫抑制能力增強。Treg細胞分化成熟過程和功能與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3基因缺陷可導(dǎo)致Treg細胞功能下降，提示Foxp3對于維持Treg細胞功能至關(guān)重要[32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非諾貝特顯著上調(diào)小鼠淚腺中Foxp3表達水平，既往報道也支持了本研究結(jié)果：Chang等[33]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的自身免疫性心肌炎大鼠的CD4+T細胞中，非諾貝特增強其Foxp3基因表達。綜上所述，非諾貝特可能通過促進Treg細胞的分化和功能，促進抑炎因子分泌，從而減輕組織的損害和疾病的進展。

本研究結(jié)果表明，非諾貝特可明顯減輕NOD小鼠的干眼癥狀，為SS相關(guān)干眼的治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究的局限性在于，我們僅檢測不同時期小鼠角膜熒光素鈉染色和淚液分泌量，但缺乏對各組小鼠淚腺組織病理學(xué)的動態(tài)觀察，需進一步探索以完善研究。