基于mTOR/Beclin1通路探討血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織自噬和炎癥小體的影響

洪寅雯，文 科，吳本升，徐治中，杜 駿，高 瑩，孫薛亮

(1.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

克羅恩病是累及全消化道的慢性、難治性、非特異性腸道炎癥性疾病，在中國(guó)發(fā)病率呈急劇上升趨勢(shì)。透壁性炎癥是克羅恩病的主要病理特征，可導(dǎo)致多種致殘性并發(fā)癥，如腸管狹窄、腸梗阻、腸穿孔和復(fù)雜性肛瘺。盡管多種生物制劑，如英夫利西單抗、烏司奴單抗和維得利珠單抗能實(shí)現(xiàn)克羅恩病無激素緩解和腸黏膜愈合，但僅有部分患者獲益，有相當(dāng)比例的患者原發(fā)性無應(yīng)答或繼發(fā)性失應(yīng)答[1-3]。探尋克羅恩病的病因病機(jī)及有效治療藥物是重要的研究方向?，F(xiàn)有研究[4]表明，克羅恩病腸道病變主要位于腸系膜側(cè)，并且系膜血管增生影像學(xué)上呈現(xiàn)梳狀征?？肆_恩病患者血液循環(huán)呈高凝狀態(tài)，血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[5]。由此可見，中醫(yī)理論體系中的血絡(luò)學(xué)說在克羅恩病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。國(guó)醫(yī)大師徐景藩認(rèn)為，瘀血是炎癥性腸病的重要致病因素[6]。課題組前期基于吳門醫(yī)派絡(luò)病理論“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”“久病必有瘀”，以及《醫(yī)林改錯(cuò)》記載的治法“治泄瀉病日久不愈，作瘀血治”“百藥無效，活血一法”，建立活血通絡(luò)治則治法，運(yùn)用宋代朱端章《衛(wèi)生家寶產(chǎn)科備要》中血竭散(血竭、沒藥各6 g)治療克羅恩病，取得較好臨床療效，但作用機(jī)制尚不明確。近年研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，腸黏膜組織中細(xì)胞自噬和炎癥小體過度活化與克羅恩病發(fā)病密切相關(guān)，抑制自噬和炎癥小體可減輕克羅恩病腸道炎癥反應(yīng)。本研究通過建立克羅恩病大鼠模型，觀察血竭散對(duì)大鼠結(jié)腸炎的治療作用及其對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)/Beclin1通路介導(dǎo)的自噬和NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)、黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)炎癥小體的影響，為治療克羅恩病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 36只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0049。實(shí)驗(yàn)前大鼠于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件[保持通風(fēng)，室溫(24±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，每12 h進(jìn)行一次亮/暗循環(huán)]下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，混合飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2020倫動(dòng)批021)。

1.2 主要試劑和儀器 血竭(產(chǎn)地云南，批號(hào) 200406003)、沒藥(產(chǎn)地廣西，批號(hào) 200601003)：蘇州市天靈中藥飲片有限公司，所有藥物經(jīng)蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部沈多榮副主任藥師鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)；柳氮磺砒啶(sulfasalazine，SASP；批號(hào) 20150608，每片0.25 g)：上海三維制藥有限公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS；P2297)和Trizol試劑盒(T9424)：美國(guó)Sigma公司；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)試劑盒(PI303)、IL-18試劑盒(PI553)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α， TNF-α)試劑盒(PT516)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；mTOR抗體(ab134903)、p-mTOR抗體(ab278621)、Beclin1抗體(ab207612)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3β(microtubule-associated protein light chain 3 beta，LC3B)抗體(ab192890)、NLRP3抗體(ab263899)、AIM2抗體(ab119791)、含Caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated space-like protein containing a Caspase recruitment domain,ASC)抗體(ab180799)、Caspase 1抗體(ab138483)：美國(guó)Abcam公司；SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(740703)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037B)：日本Takara公司。光學(xué)顯微鏡(BX45A)：日本Olympus公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(WD-2102A)和凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413B)：北京六一生物科技有限公司；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)：美國(guó)伯樂公司。

2 方法

2.1 藥物制備 采用乙醇提取血竭散有效成分。具體方法如下：血竭、沒藥研末后，經(jīng)95%乙醇加熱回流2 h，重復(fù)進(jìn)行2次，合并提取液，水浴揮干溶劑，以二甲基亞砜助溶得到濃度為200 mg/mL的溶液，流通蒸汽滅菌30 min，常溫保存待用。計(jì)算提取液與生藥換算比。

2.2 動(dòng)物分組和模型復(fù)制 將36只大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，血竭散低、中、高劑量組和SASP組，每組6只。參照文獻(xiàn)[10]方法建立TNBS誘導(dǎo)的克羅恩病大鼠模型。具體方法如下：大鼠禁食、不禁水24 h后，10%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，通過3.5 F導(dǎo)管將0.25 mL TNBS與50%乙醇的混合溶液注入距肛緣4 cm結(jié)腸內(nèi)，給藥后將大鼠倒置60 s，避免藥液流出。每周重復(fù)1次，持續(xù)6周。TNBS劑量逐周遞增：第1周15 mg，第2周30 mg，第3周45 mg，第4、第5和第6周分別60 mg?？瞻捉M同時(shí)間點(diǎn)予等容積生理鹽水灌腸。

2.3 藥物干預(yù) 空白組和模型組每日分別給予生理鹽水灌胃；血竭散低、中、高劑量組根據(jù)臨床用量換算，每日分別給予0.63、1.26、2.52 g/kg血竭散灌胃；SASP組每日給予0.5 g/kg SASP灌胃。與模型復(fù)制過程同時(shí)進(jìn)行，連續(xù)給藥40 d。

2.4 標(biāo)本采集 40 d后，大鼠禁食不禁水24 h，使用CO2處死大鼠后立即剖腹，取出全結(jié)腸并解剖，立即用4 ℃生理鹽水快速漂洗，距肛緣3、5 cm處各剪取長(zhǎng)約1 cm腸管，迅速置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z測(cè)。

2.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變 PBS洗滌結(jié)腸組織，乙醇脫水，二甲苯清洗，石蠟包埋，切取5 μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]：僅為結(jié)構(gòu)改變(0分)；可見慢性炎癥(1分)；固有層見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(2分)；上皮層見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(3分)；隱窩結(jié)構(gòu)破壞(4分)；見糜爛或潰瘍(5分)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)水平 RIPA裂解液裂解組織勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。將樣品加入已包被的反應(yīng)孔中，室溫下孵育1.5 h。洗滌后，于各孔中加入酶標(biāo)抗體，室溫下孵育1 h。洗滌后，于各孔中加入TMB顯色液，室溫下孵育0.5 h后終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)得各孔450 nm處光密度(optical density， OD)值，根據(jù)OD值計(jì)算相應(yīng)濃度。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織中Beclin1、NLRP3和AIM2 mRNA表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說明書，用Trizol試劑提取結(jié)腸組織總RNA，采用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，GAPDH作為內(nèi)參基因。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，再用SYBR Green試劑完成熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值計(jì)算Beclin1、NLRP3和AIM2相對(duì)表達(dá)水平，用2-ΔΔCT表示。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2.8 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)腸組織中LC3B表達(dá)水平 將大鼠結(jié)腸組織在10%中性甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切成5 μm切片。樣本脫蠟，再水合，用1%牛血清白蛋白孵育，隨后浸泡在H2O2中淬火。加入一抗，4 ℃下孵育12 h。再加入二抗，室溫下孵育1 h。DAPI進(jìn)行反染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察并捕獲熒光細(xì)胞。

2.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織中mTOR、p-mTOR、Beclin1、NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)水平 用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解組織勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心20 min。收集上清液，用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度，使各組一致。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%牛奶溶液中室溫下封閉1.5 h，然后用TBST漂洗3次，加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h后用TBST漂洗3次，顯影，使用ECL-plus檢測(cè)系統(tǒng)使蛋白印跡可視化，用灰度分析軟件對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行量化，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)的影響 模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮損傷，隱窩減少，固有層見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理學(xué)評(píng)分顯著高于空白組(P<0.05)，提示模型復(fù)制成功。血竭散及SASP干預(yù)后，結(jié)腸黏膜上皮損傷減輕，隱窩數(shù)量增加，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞顯著減少；與模型組比較，血竭散各劑量組及SASP組結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見圖1和表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

注：A.模型組；B.血竭散低劑量組；C.血竭散中劑量組；D.血竭散高劑量組；E.SASP組；F.空白組

3.2 血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α水平均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，血竭散各劑量組及SASP組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α濃度顯著降低(P<0.05)，血竭散的效應(yīng)呈劑量依賴性。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)水平比較

3.3 血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織中Beclin1、NLRP3和AIM2 mRNA表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中Beclin1、NLRP3和AIM2 mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，血竭散各劑量組及SASP組大鼠結(jié)腸組織中Beclin1、NLRP3和AIM2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，血竭散的效應(yīng)呈劑量依賴性。見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中Beclin1、NLRP3和AIM2 mRNA表達(dá)水平比較

3.4 血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織中炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，血竭散各劑量組及SASP組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，血竭散的效應(yīng)呈劑量依賴性。與血竭散中劑量組比較，SASP組NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)水平均無明顯變化(P>0.05)。見圖2和表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

注：A.模型組；B.血竭散低劑量組；C.血竭散中劑量組；D.血竭散高劑量組；E.SASP組；F.空白組

3.5 血竭散對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、Beclin1和LC3B表達(dá)的影響 免疫熒光染色顯示模型組大鼠結(jié)腸組織中LC3B表達(dá)水平較空白組顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)為紅色熒光；血竭散和SASP干預(yù)后LC3B表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，血竭散的效應(yīng)呈劑量依賴性。見圖3和表6。蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組、血竭散各劑量組及SASP組大鼠結(jié)腸組織中mTOR表達(dá)水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組p-mTOR表達(dá)水平顯著降低，Beclin1表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，血竭散各劑量組及SASP組p-mTOR表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Beclin1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，血竭散的效應(yīng)呈劑量依賴性。見圖4和表6。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中LC3B、mTOR、p-mTOR和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

注：A.模型組；B.血竭散低劑量組；C.血竭散中劑量組；D.血竭散高劑量組；E.SASP組；F.空白組

注：A.模型組；B.血竭散低劑量組；C.血竭散中劑量組；D.血竭散高劑量組；E.SASP組；F.空白組

4 討論

抗TNF-α制劑的問世，使克羅恩病腸黏膜愈合得以實(shí)現(xiàn)。然而，以IL-12/IL-23為靶點(diǎn)的烏司奴單抗、整合素α4β7為靶點(diǎn)的維得利珠單抗的出現(xiàn)，表明單一靶點(diǎn)難以治愈克羅恩病。越來越多的炎癥性腸病患者尋求中醫(yī)藥的治療[12]?；钛ńj(luò)法治療炎癥性腸病既活血通絡(luò)，又化瘀止血，達(dá)到活血不傷血、止血不留瘀的治療目標(biāo)[13]。血竭具有活血化瘀、定痛止血、斂瘡生肌等功效，被譽(yù)為“活血之圣藥”，能很好地實(shí)現(xiàn)上述治療目標(biāo)。因而，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)推薦血竭治療炎癥性腸病[14]。本研究結(jié)果顯示，以血竭為君藥的血竭散能減輕克羅恩病大鼠結(jié)腸組織損傷，抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)，從分子生物學(xué)角度明確其緩解克羅恩病腸炎的作用。

IL-1β和IL-18的表達(dá)與炎癥小體活化密切相關(guān)。炎癥小體是固有免疫的重要組成部分，可保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)外部致病因素的入侵。然而，過度活化的炎癥小體與多種自身炎癥性疾病相關(guān)?；顒?dòng)性克羅恩病患者結(jié)腸黏膜中NLRP3和AIM2炎癥小體表達(dá)水平顯著增加[8-9]。NLRP3通過識(shí)別病原體或損傷相關(guān)分子模式，而AIM2通過識(shí)別細(xì)胞質(zhì)雙鏈DNA活化，與ASC和Caspase-1結(jié)合，形成炎癥小體，分泌IL-1β和IL-18。在TNBS或葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中，NLRP3炎癥小體通過分泌IL-18，修復(fù)損傷的結(jié)腸上皮組織，維持腸黏膜屏障的完整性，降低通透性，抑制結(jié)腸炎；同樣，AIM2炎癥小體通過調(diào)控腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，阻止結(jié)腸組織損傷，抑制炎癥反應(yīng)[15-16]。然而，慢性結(jié)腸炎模型中，NLRP3和AIM2炎癥小體過度活化，分泌過多的IL-1β和IL-18，強(qiáng)化腸黏膜炎癥反應(yīng)[17-18]。抑制NLRP3和AIM2炎癥小體活化，是克羅恩病的潛在治療策略。本研究結(jié)果顯示，TNBS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎模型中，NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1表達(dá)水平增加，分泌過多的IL-1β和IL-18。血竭散干預(yù)能下調(diào)NLRP3、AIM2、ASC和Caspase-1表達(dá)水平，抑制炎癥小體過度活化。

Feng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR/Beclin1信號(hào)通路調(diào)控的自噬活化能激活NLRP3炎癥小體，破壞腸上皮細(xì)胞屏障功能。自噬是一種分解代謝細(xì)胞過程。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解細(xì)胞內(nèi)病原體、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器。自噬失調(diào)在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，自噬相關(guān)基因ATG16L1和IRGM突變與克羅恩病的發(fā)病密切相關(guān)[20]。當(dāng)腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬缺陷時(shí)，入侵的病原體清除減少，致使腸道菌群和Th17/Treg比例失調(diào)，激活免疫應(yīng)答，誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)[21]。然而，持續(xù)的炎癥刺激可使炎癥性腸病患者腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬過度活化，加重腸道炎癥[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與輕度潰瘍性結(jié)腸炎患者和健康人群比較，中重度患者腸上皮細(xì)胞內(nèi)可觀察到更多的自噬體，并且自噬水平的增加與疾病嚴(yán)重度呈正相關(guān)。抑制過度活化的自噬能改善克羅恩病小鼠結(jié)腸炎[7，23-24]。MTOR和Beclin1是自噬的經(jīng)典調(diào)控基因，前者通過磷酸化UNC-51樣激酶1抑制自噬啟動(dòng)；而后者與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶構(gòu)成復(fù)合體，啟動(dòng)自噬體形成。本研究結(jié)果顯示，TNBS誘導(dǎo)建立克羅恩病慢性結(jié)腸炎模型后，大鼠結(jié)腸組織中p-mTOR表達(dá)水平降低，Beclin1和LC3B表達(dá)水平增加，自噬水平升高。血竭散干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)p-mTOR、Beclin1和LC3B表達(dá)水平，抑制大鼠結(jié)腸組織中過度活化的自噬。

綜上所述，血竭散可能通過調(diào)控mTOR/Beclin1信號(hào)通路，抑制自噬和NLRP3、AIM2炎癥小體過度活化，減少促炎細(xì)胞因子分泌，緩解克羅恩病大鼠結(jié)腸炎。