芒果食葉象甲的生物學(xué)特性及其rDNA-ITS1序列特征分析

楊翠鳳，滕 崢，歐陽秋飛，蘇仕林

（百色學(xué)院 農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

芒果象甲(SternochetusPierce)是芒果的重要害蟲之一，屬于鞘翅目(Coleoptera)象蟲科(Curcμ-Lionidae)隱喙象亞科(Cryptorhynchinae)洞腹象屬(Sternochetus)［1］，為害種類多且難以消除，為害果核的有芒果果核象甲(S. mangiferaeFabricius)、芒果果實象甲(S. olivieriFaust)，為害果肉的有芒果果肉象甲(S. frigidusFabricius)，而為害葉片和嫩梢的有芒果切葉象甲(Deporaus marginatusPascoe)及其他食葉象甲。芒果象甲在國外主要分布在亞洲的印度、巴基斯坦、越南等芒果的重要產(chǎn)區(qū)，國內(nèi)主要分布于廣西、廣東、海南、福建、江西及臺灣省等部分芒果種植地［2］。芒果樹一旦受到象甲蟲的為害，若不及時防治，便會直接帶來芒果產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)的損失。因此，盡早發(fā)現(xiàn)和識別芒果象甲是有效防治的關(guān)鍵。本課題組前期對百色地區(qū)具有代表性的芒果種植園進(jìn)行芒果象甲種類和為害調(diào)查，調(diào)查結(jié)果表明芒果食葉象甲的為害率和蟲情指數(shù)最高，主要發(fā)生在抽梢期和開花期，以嫩梢和葉片為食，導(dǎo)致嫩梢及嫩葉卷曲、殘缺不全，有的枝梢甚至發(fā)生枯萎、萎蔫的現(xiàn)象［3-4］。rDNA-ITS基因片段是現(xiàn)在公認(rèn)的DNA條形碼有效候選片段之一，廣泛應(yīng)用于動植物的鑒定系統(tǒng)發(fā)育的探討和親緣關(guān)系的研究［5-7］。前人已利用rDNA-ITS序列開展了吸血蠓［8］、蘋果異脛小卷蛾［9］、香蕉穿孔線蟲［10］等的分子鑒定，利用rDNA-ITS序列分析法鑒定了桑椹菌核病病原菌［11］，利用rDNA-ITS1或ITS2基因?qū)κ唪~［12］、飛虱［13］、米爾頓姬小蜂［14］序列及其分子系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析等。rDNA-ITS序列的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)識別的不足，為昆蟲領(lǐng)域分子生物學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究擬在前期調(diào)查分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了芒果食葉象甲生物學(xué)特征的觀測及rDNA-ITS1序列克隆和親緣關(guān)系的分析，以期為今后開展芒果象甲的分子鑒定、種群遺傳多樣性及防治等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在實地調(diào)查的基礎(chǔ)上，采集芒果食葉象甲成蟲，對其中的13頭芒果食葉象甲成蟲進(jìn)行rDNAITS1序列擴(kuò)增與分析，編號為1-1～1-13；試驗藥品主要為DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、PCR引物、DNA Tap酶等；試驗儀器主要有捕蟲器、展翅板、昆蟲針、鑷子、養(yǎng)蟲盒(25 cm×10 cm)、放大鏡、體視顯微鏡、水浴鍋、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 芒果食葉象甲的種類與為害調(diào)查 使用隨機(jī)定點調(diào)查的方式，于2018年3月—2019年6月對百色市右江區(qū)六苜村、田陽區(qū)峒芒村、田東縣六聯(lián)村的芒果種植園進(jìn)行調(diào)查，每個園區(qū)隨機(jī)選擇30株芒果樹，分別選取東、南、西、北、中5個方位調(diào)查點的2～3根枝條作為固定調(diào)查對象。結(jié)合芒果物候期，如抽梢期、花期、坐果期等進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計分析芒果食葉象甲在百色地區(qū)的發(fā)生情況與為害程度，為害嚴(yán)重程度用重(+++)、中(++)、輕(+)表示。

1.2.2 芒果食葉性象甲生物學(xué)特性觀察 分別在田間調(diào)查與實驗室飼養(yǎng)環(huán)境下，觀察和記錄芒果食葉性象甲的生物學(xué)特征，包括形態(tài)特征、生活史和生活習(xí)性等。

1.2.3 基因組總DNA提取 采用小批量DNA提取試劑盒（由上海碧云天生物科技有限公司生產(chǎn)）提取象甲蟲基因組的總DNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.4 rDNA-ITS1序列擴(kuò)增 引物為通用引物，ITS1F：5′-TAT AGC ATT CCC CGT TTA-3′，ITS1R：5′-TCC TAA TAA ACC AAT TGC-3′，由深圳華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL，DNA模板4 μL、ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD18-T連接載體，轉(zhuǎn)入E. coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送至深圳華大基因測序部測序。

1.2.5 序列分析 采用DNAStar軟件的MegAlign對序列進(jìn)行比對分析，比對后的序列在View中Sequence Distance進(jìn)行遺傳分歧及遺傳相似性計算，運用Editseq軟件進(jìn)行堿基含量分析。利用MEGA 5.05軟件中Phylogeny工具進(jìn)行序列組成分析，運用NJ法(Neighbor-Joining Tree)自展1000次建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果食葉象甲的種類與為害程度

經(jīng)調(diào)查，在六苜村、峒芒村和六聯(lián)村的芒果種植基地共發(fā)現(xiàn)4種食葉象甲，為害程度最高的是芒果切葉象甲(Deporaus marginatusPascoe)，其次是芒果藍(lán)卷葉象(Involvulussp.)和綠鱗象甲(Hypomences squamosusFabricius)，為害程度相對較低的是小綠象甲(Platymycteropsis mandarinusFaimaire)(表1)［3］。其中，芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象主要為害芒果新長出的嫩梢和嫩葉；綠鱗象甲、小綠象甲通過咬食葉片，使芒果葉片殘缺不全，影響芒果樹的生長。

表1 芒果食葉象甲種類與為害程度

2.2 芒果食葉象甲的生物學(xué)特性

本次調(diào)查結(jié)果表明，百色芒果種植基地以芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象、綠鱗象甲3種食葉性象甲的為害程度較高，因而進(jìn)一步觀察和記錄芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象和綠鱗象甲的生物學(xué)特性，以期為百色地區(qū)芒果象甲為害的監(jiān)測、防治提供一定的參考。

2.2.1 芒果切葉象甲的生物學(xué)特性 芒果切葉象甲，又稱為切葉象甲、切葉虎等，其分布范圍較廣，在海南、云南、廣西、廣東及臺灣省等芒果種植地區(qū)均有發(fā)生，是華南地區(qū)為害芒果樹嫩梢的重要害蟲之一。成蟲咬食芒果樹嫩梢葉的上表皮而留下嫩葉的下表皮，使葉片卷縮、干枯、萎蔫，雌成蟲在嫩葉上產(chǎn)卵后，在近葉片的基部將其橫向咬斷，使帶卵部分落到地面上，葉片基部留下類似剪刀剪過的痕跡。幼蟲孵化后潛藏在嫩葉肉內(nèi)，被害處可見蜿蜒曲折潛食過的隧道痕跡，然后逐漸擴(kuò)張形成大大小小的成片斑塊，最后僅剩兩面表皮，從而影響了芒果樹的光合作用和生長發(fā)育。

形態(tài)特征：體長約6 mm，褐色，身體表面有白色絨毛，觸角、復(fù)眼以及喙均為黑色。鞘翅褐色，每個翅上有10行，肩角圓鈍，足腿為褐色。卵為長橢圓形，隨著生長發(fā)育過程的推進(jìn)，卵的顏色由乳白色向逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，且表面光滑。幼蟲為無足型，初孵化時為乳白色，然后逐漸變成淡黃色，腹部的各節(jié)之間兩側(cè)各有1對小肉刺。蛹為裸蛹，淡黃色，隨著發(fā)育過程的推進(jìn)而逐漸向茶褐色過渡，頭部開始出現(xiàn)乳狀突起，末節(jié)有肉刺1對。

生活史：芒果切葉象甲在百色地區(qū)1年內(nèi)發(fā)生4代，第1代成蟲在5月末，第2代成蟲在7月中旬，第3代成蟲在8月下旬，第4代成蟲在9月中旬。成蟲的壽命比較長，世代可以重疊在一起生長，夏、秋季每代長達(dá)30 d左右，冬季處于靜伏期。以幼蟲在土壤越冬，次年3月中旬至4月初羽化成為成蟲，成蟲出土后飛向地面為害芒果嫩梢、啃食嫩葉，3～5 d后開始交尾，交尾后1～2 d內(nèi)開始產(chǎn)卵，成蟲產(chǎn)卵量250粒/頭左右，卵期4～6 d。卵產(chǎn)于芒果嫩葉正面主脈組織中。產(chǎn)卵后，成蟲橫向咬食葉肉，像剪刀一樣將葉面平整切斷，使其所產(chǎn)的卵隨葉片落到地面上；4月中旬，幼蟲孵出后由主脈向兩側(cè)潛食葉肉，幼蟲期6 d左右，老熟后入土化蛹。蛹室深度2～3 cm，蛹期20～30 d，芒果切葉象甲每年自5月起世代重疊。芒果切葉象甲在百色地區(qū)1年有2個為害高峰期：5月下旬至6月，芒果抽梢盛期受害最嚴(yán)重；8月上旬至9月中下旬，正值芒果秋梢期，受害也比較嚴(yán)重。

生活習(xí)性：群集取食，主要取食芒果嫩葉，聚集一起的成蟲共同啃食葉片，直至葉片脫落；成蟲具有假死性，受震動或被觸時，立即收攏足和觸角，墜地假死。求偶交尾：雄蟲在求偶交尾過程中占主導(dǎo)地位，圍繞在雌蟲周圍，用觸角試探，等雌蟲進(jìn)食完畢，爬到雌蟲背部進(jìn)行交尾，交尾通常發(fā)生在晴天的上午，每次交尾時間約2 min。產(chǎn)卵切葉：雌蟲選擇新鮮的嫩葉片，從葉片中脈基部向葉邊緣開始咬切，當(dāng)半邊葉片完全切開后，在合適的部位開始產(chǎn)卵，每產(chǎn)1枚卵隨即對產(chǎn)卵孔用喙來回?fù)崞?。幼蟲有避光性，孵化1周后則進(jìn)入土中，構(gòu)造蛹室，化成蛹。

2.2.2 芒果藍(lán)卷葉象的生物學(xué)特性 芒果藍(lán)卷葉象，亦稱藍(lán)色象鼻蟲，該蟲分布范圍廣，各芒果種植區(qū)均發(fā)現(xiàn)該蟲的為害。成蟲主要利用其長象鼻吸食芒果嫩梢汁液，造成芒果嫩梢干枯萎蔫甚至整個植株枯萎死亡，為害較嚴(yán)重。

形態(tài)特征：成蟲長、寬分別約為6、3 mm。身體藍(lán)黑色有光澤，表面有絨毛，頭部深棕色，有細(xì)恒皺紋，喙較長，兩端寬中間窄，后背處有兩淺縱凹溝，觸角棒節(jié)大且扁，肩角圓鈍，翅坡處寬，各足無齒。幼蟲、蛹均為黃白色。

生活史：在百色地區(qū)1年發(fā)生2代，在植物附近的枯樹枝下、磚石或土縫中越冬，越冬成蟲于3月初出土，成蟲于芒果抽梢季節(jié)的3—6月進(jìn)入盛發(fā)期，4月初至9月底產(chǎn)卵，卵期1周左右，于4月下旬開始幼蟲孵化，約為30 d，5月中旬開始化蛹，蛹期歷時15～30 d，6月初羽化的成蟲開始出土活動，10月下旬羽化的成蟲在土壤中潛伏越冬。

生活習(xí)性：成蟲具有假死性及群集性取食，主要為害芒果的嫩枝梢，用其象鼻食吸食芒果嫩梢的汁液，聚集一起的成蟲共同吸食嫩梢，直到嫩梢干枯萎蔫。成蟲為害芒果嫩梢時，先用象鼻挖一個孔洞，孔洞繞枝干呈螺旋形或呈圓周形整齊而緊密地排列，在嫩梢上形成一圈環(huán)狀的孔洞，為害嚴(yán)重時，一條嫩枝梢上有3～4圈整齊排列的孔洞?？锥葱纬珊螅上x便選擇其中的孔洞產(chǎn)卵。芒果嫩枝的皮層被扎孔后，上部葉片便失水萎垂，直至整個嫩梢干枯。

2.2.3 綠鱗象甲的生物學(xué)特性 綠鱗象甲，別名藍(lán)綠象、綠絨象蟲、大綠象蟲等，是為害我國農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)作物的重要害蟲之一，該蟲為害的作物類別較多，以成蟲取食作物嫩葉、嫩芽及嫩梢為主，常造成葉片及枝條殘缺不全或葉片留下大大小小的孔洞，為害嚴(yán)重時還會造成大量的落花、落果。在百色地區(qū)，該蟲除了為害芒果外，還為害油茶、柑橘、甘蔗、桑樹等農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)剞r(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物的健康發(fā)展。

形態(tài)特征：成蟲長約16 mm，身體大多呈綠色，表面覆蓋一層閃光的綠色鱗毛，少數(shù)是黃色及灰色。喙扁平，中間有寬而深的中縫，復(fù)眼較突出，背部中央有縱溝，小盾片呈三角形，與雄蟲相比較，雌蟲腹部較大。卵呈橢圓形，體長1 mm左右，黃白色，接近孵化前逐漸變?yōu)楹谏Ｓ紫x隨著發(fā)育過程的推進(jìn)，體色逐漸由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S白色，體長15～17 mm。體表多皺，無足。蛹為黃白色，長13～15 mm。

生活史：在百色地區(qū)1年發(fā)生2代。4—6月成蟲盛發(fā)，越冬成蟲于3月中旬爬出地面活動，5月中旬至下旬進(jìn)入盛發(fā)活躍期，8月中旬成蟲開始減少活動，4月下旬至10月中旬為產(chǎn)卵期，每只雌蟲能產(chǎn)80枚卵，5月上旬至10月中旬為幼蟲孵化期，幼蟲活動期歷時3個月左右，9月中旬、10月中旬幼蟲老熟后在土壤中化蛹，蛹期為15～20 d，9月下旬羽化的成蟲只有極個別出來活動，10月羽化的成蟲在土壤中潛伏越冬。

生活習(xí)性：成蟲白天較活躍，晚上活躍性不強(qiáng)，成蟲爬行能力較強(qiáng)，飛行能力較弱，具有聚集性和假死性，出土后爬至枝梢啃食為害嫩葉，取食活躍，造成芒果樹枝梢葉片殘缺不全，進(jìn)而影響了芒果樹的正常生長發(fā)育。雌雄成蟲交配頻繁，每次交配時間為5～6 h，將卵產(chǎn)于葉片上，幼蟲孵化后進(jìn)入土壤中取食雜草及樹根，靠近雜草多的芒果園往往受害較嚴(yán)重。

2.3 芒果食葉象甲的rDNA-ITS1序列分析

13頭芒果食葉象甲的rDNA-ITS1序列長度在988～1240 bp之間，具體的堿基組成特征見表1，其中A+T含量(638～862 bp)為64.37%～74.89%，明顯高于C+G含量(252～389 bp)的25.11%～35.56%，堿基組成表現(xiàn)出明顯的A+T偏好性特點，而且堿基的轉(zhuǎn)換以顛換為主。

表2 芒果食葉象甲的rDNA-ITS1序列特征

2.4 rDNA-ITS1序列的同源性分析

采用DNAStar軟件的MegAlign程序中Alignment Report對所得到的芒果食葉象甲rDNA-ITS1序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明：芒果象甲種群之間存在一定程度的遺傳分歧和相似性，其中，遺傳分歧最大的是象甲1-6與1-7、1-3與1-6，序列相似性均僅為37.0%，而遺傳相似性最高的為象甲1-8與1-9，相似性為100.0%(表3)。

表3 芒果象甲rDNA-ITS1序列的相似性

2.5 象甲蟲之間的親緣關(guān)系分析

NJ進(jìn)化樹將13頭芒果食葉象甲分為2大類群(圖1)，象甲1-4與1-6的親緣關(guān)系較近，與其他象甲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聚為1個分支，其余12頭象甲具有較高的相似性，組成另1個分支，其中象甲1-2單獨為1個亞類群，其余10頭象甲聚為另1個亞類群。

圖1 基于rDNA-ITS1序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 芒果食葉象甲的種類與為害程度

經(jīng)調(diào)查，百色地區(qū)為害指數(shù)較高的芒果食葉象甲依次是芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象、綠鱗象甲，這3種象甲通過為害嫩梢、嫩葉等，導(dǎo)致芒果的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響了芒果果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過觀察芒果食葉象甲成蟲的形態(tài)學(xué)及其產(chǎn)卵、孵化、幼蟲、成蟲發(fā)育的生活史等生物學(xué)特性，初步掌握了百色地區(qū)芒果食葉象甲種類、為害分布及其生活習(xí)性。本研究結(jié)果可為百色地區(qū)的芒果象甲為害的監(jiān)測、防治提供一定的借鑒，為促進(jìn)百色地區(qū)芒果質(zhì)量和產(chǎn)量的提高，推動芒果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展提供一定的參考。

3.2 rDNA-ITS1基因序列同源性及堿基含量比較

目前，國內(nèi)對芒果象甲的鑒別主要是通過形態(tài)學(xué)方法來完成，然而形態(tài)學(xué)觀察耗時長，而且由于幼蟲時期或者成蟲標(biāo)本不完整，給鑒定工作帶來了諸多不便。因此，單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定難以快速獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，而分子鑒定技術(shù)能很好地解決這一難題。rDNA是生物體內(nèi)最保守的基因之一，其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)具有極大的種間甚至種內(nèi)的變異性，被認(rèn)為是發(fā)展敏感、特異檢測系統(tǒng)的理想靶物［7,15-17］。本研究克隆獲得了13頭芒果食葉象甲的rDNA-ITS1基因序列，通過分析序列堿基組成及同源性表明，rDNA-ITS1基因序列的堿基組成表現(xiàn)出明顯的A+T偏好性特點，遺傳距離表明芒果象甲之間存在一定程度的遺傳分化，證實rDNA-ITS1基因序列能較好地反映出芒果食葉象甲之間的差異性和相似性。

3.3 基于rDNA-ITS1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于rDNA-ITS1基因序列探討了13頭芒果食葉象甲之間的親緣關(guān)系，從NJ進(jìn)化樹可以看出，rDNA-ITS1基因序列可以將13頭芒果食葉象甲分為2大類群：象甲1-4與1-6的親緣關(guān)系較近，而與其他象甲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聚為1個類群；象甲1-2單獨為1個亞類群；其余10頭象甲的親緣關(guān)系較近聚為另1個亞類群。聚類分析結(jié)果與基于mtDNA-COI序列的研究結(jié)果一致［18］。本研究結(jié)果反映了種群間遺傳關(guān)系既具有一定的相似性，又存在一定的遺傳分化。由此證明了今后可以將rDNA-ITS1基因序列用于芒果象甲蟲種群遺傳多樣性分析以及分子鑒定等。

4 結(jié)論

經(jīng)筆者的調(diào)查顯示，百色地區(qū)為害指數(shù)較高的芒果食葉象甲依次是芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象、綠鱗象甲，這3種象甲的存在嚴(yán)重影響了芒果的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過進(jìn)一步觀察芒果食葉象甲的生物學(xué)特性，初步掌握了芒果切葉象甲、芒果藍(lán)卷葉象和綠鱗象甲的為害分布特征及其生活習(xí)性，為百色地區(qū)的芒果象甲為害的監(jiān)測、防治提供一定的借鑒。通過克隆獲得了13頭芒果食葉性象甲的rDNA-ITS1基因序列，結(jié)果表明：rDNA-ITS1序列堿基含量表現(xiàn)出明顯的A+T偏好性特點；13頭芒果象甲蟲之間存在一定的遺傳分化，NJ發(fā)育樹將其分為2大類群，其中，象甲1-4、1-6與其他象甲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聚為1個分支，其余12頭象甲具有較高的相似性，組成另1個分支，本研究結(jié)果與基于mtDNA-COI序列的研究結(jié)果高度一致。由此表明，rDNA-ITS1基因序列在一定程度上能夠反映出芒果象甲之間的遺傳分化和相似性，可為今后開展芒果象甲的分子鑒定、種群親緣關(guān)系及防治等研究奠定基礎(chǔ)。