3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高山杜鵑組培苗保存的影響

李莎莎，李雪嬌，趙正雄，解瑋佳，李世峰，宋 杰，張 露，彭綠春，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國(guó)家觀(guān)賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南花卉技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650205）

0 引言

杜鵑花屬(RhododendronL.)是世界著名的木本花卉，其花冠碩大、顏色鮮艷，觀(guān)賞價(jià)值高，是近年來(lái)中國(guó)年宵花和高檔園林造景的新秀，市場(chǎng)前景較好［1，2］。杜鵑通常采用嫁接、扦插、播種等方法繁殖［3］，但這些繁殖方法會(huì)受母株材料、季節(jié)等因素的影響且工作量大，不宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。杜鵑組織培養(yǎng)體系的建立不僅可以加快繁殖速度，而且不受季節(jié)影響，對(duì)杜鵑的引種和規(guī)?；⑸虡I(yè)化生產(chǎn)具有重要意義［4］。在試管苗繼代保存過(guò)程中，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡和失水干裂，需將試管苗接種到新的培養(yǎng)基中，但多次繼代繁殖會(huì)導(dǎo)致組培苗繁殖能力下降，變異概率提高，同時(shí)也增加了繁瑣的人工操作過(guò)程［5］，因此，通過(guò)添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)延緩植物生長(zhǎng)以減少繼代培養(yǎng)的次數(shù)，對(duì)杜鵑種質(zhì)資源的保存具有重要意義。

在高山杜鵑的生產(chǎn)過(guò)程中，新品種培育和種質(zhì)保存日益受到關(guān)注，植物種質(zhì)資源離體保存主要是利用生物技術(shù)，在無(wú)菌培養(yǎng)條件下，通過(guò)添加各類(lèi)生長(zhǎng)抑制劑，使植物生長(zhǎng)延緩或停止，減少繼代次數(shù)，以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的［6］。植物離體保存技術(shù)包括緩慢生長(zhǎng)離體保存和超低溫離體保存2種［7］，緩慢生長(zhǎng)離體保存是在常規(guī)培養(yǎng)條件下對(duì)培養(yǎng)材料限制生長(zhǎng)的保存方法，保存時(shí)間較短，需定期繼代；超低溫保存是指在-80 ℃以下的溫度（一般用液氮）對(duì)植物種質(zhì)資源進(jìn)行保存，超低溫保存一般有4種方法，即玻璃化法超低溫保存、小滴玻璃化法超低溫保存、包埋玻璃化法超低溫保存和包埋脫水法超低溫保存［8-9］，無(wú)需繼代，品種不容易發(fā)生變異［10］，但超低溫保存植物的生長(zhǎng)恢復(fù)周期較長(zhǎng)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是由人工合成用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要的調(diào)控作用，可以促進(jìn)插條生根、控制株形、調(diào)控花期、提高抗逆性，并且還能解除休眠，增加分蘗和分球數(shù)目，提高繁殖率［11-12］。在果蔬作物、農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物和觀(guān)賞植物等方面的應(yīng)用較廣。王曉蔓等［5］在蘋(píng)果組培苗的繼代培養(yǎng)基中加入不同濃度的B9、矮壯素、PP333及脫落酸，結(jié)果表明：B9、矮壯素均有明顯的抑制作用，且莖尖存活率高，試管苗生長(zhǎng)狀況較好；蔣元斌［13］用B9、PP333和ABA分別對(duì)芋頭種質(zhì)進(jìn)行離體保存，結(jié)果表明：3種植物生長(zhǎng)延緩劑均能有效提高芋頭試管苗的成活率；晉玲等［14］用ABA、PP333保存秦艽愈傷組織取得了較好的效果；趙云龍等［15］用不同濃度的B9、PP333均可延緩大白杜鵑的生長(zhǎng)；解瑋佳等［16］用不同濃度的矮壯素、PP333處理高山杜鵑，均可使其分枝變短增粗，延緩其生長(zhǎng)；顧地周等［17］采用添加根皮苷的試管保存方法，結(jié)果表明：在試管內(nèi)采取延緩生長(zhǎng)法保存牛皮杜鵑叢生芽團(tuán)是切實(shí)可行的新方法。

目前，對(duì)杜鵑組培苗延緩生長(zhǎng)保存的研究較少，為了探索植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高山杜鵑生長(zhǎng)和抗逆性的影響，本文以2種高山杜鵑組培苗為材料，研究不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高山杜鵑組培苗種質(zhì)延緩生長(zhǎng)保存的影響。為種質(zhì)保存中減少繼代培養(yǎng)的次數(shù)、提升種苗品質(zhì)和煉苗移栽成活率等方面提供借鑒參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的高山杜鵑組培苗為紅粉佳人、諾娃，培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃。選用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為根皮苷、B9、PP333。試驗(yàn)于2020年9月—2021年6月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

以增殖培養(yǎng)30 d且長(zhǎng)勢(shì)一致的高山杜鵑瓶苗為試驗(yàn)材料，切取植株頂部往下約2 cm的莖段，分別接種于添加了不同濃度根皮苷、B9、PP333的繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基為WPM+1 mg/L ZT+0.05 mg/L NAA，pH值為5.4。3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度，根皮苷濃度分別為0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，B9濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，PP333濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，均以濃度0 mg/L作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種15個(gè)帶頂芽莖段。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 將高度一致的杜鵑組培苗接入含有相應(yīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的繼代培養(yǎng)基中，用直尺測(cè)量培養(yǎng)基表面以上的植株高度，記為h1；3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理90 d后，測(cè)量培養(yǎng)基表面以上的植株高度，記為h2，計(jì)算公式如下：

生長(zhǎng)量(cm)=h2-h1

恢復(fù)出芽率(%)=植株恢復(fù)生長(zhǎng)后萌發(fā)的新芽數(shù)/延緩生長(zhǎng)后接入普通繼代培養(yǎng)基中的植株數(shù)×100%

1.3.2 生理抗逆指標(biāo)的測(cè)定 3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理90 d后，分別從對(duì)照及各個(gè)處理的每個(gè)重復(fù)中，隨機(jī)取0.5 g植株，進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量、丙二醛含量（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和葉綠素含量等生理指標(biāo)的測(cè)定，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，以上試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.4 恢復(fù)生長(zhǎng)

3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理90 d后，將處理后的試管苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 18.0軟件分析不同處理間分化率和分化不定芽數(shù)的差異顯著性，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高山杜鵑形態(tài)的影響

由圖1可知，與對(duì)照相比，經(jīng)根皮苷處理90 d后的2種高山杜鵑植株的生長(zhǎng)量顯著降低，試管苗節(jié)間縮短，莖稈粗壯（圖1B、圖1F），諾娃植株有一定的矮化效果，部分葉片皺縮變紅；經(jīng)B9處理90 d后紅粉佳人的矮化效果與其對(duì)照植株（圖1A）相比差異不顯著（圖1C），諾娃植株上部分葉片變紅（圖1G）；經(jīng)PP333處理90 d后2種高山杜鵑植株的矮化效果較對(duì)照最為顯著（圖1D、圖1H），紅粉佳人植株的葉片亮綠，生長(zhǎng)狀況良好，諾娃植株部分葉片變紅，頂芽生長(zhǎng)受到抑制，頂部有部分葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。

圖1 3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)2種高山杜鵑形態(tài)的影響

2.2 根皮苷對(duì)高山杜鵑組培苗延緩生長(zhǎng)的影響

由表1可知，經(jīng)不同濃度根皮苷培養(yǎng)90 d后，2種高山杜鵑的生長(zhǎng)量較對(duì)照顯著降低，矮化效果顯著，表現(xiàn)出明顯的抑制生長(zhǎng)作用，其中諾娃的矮化效果更顯著。紅粉佳人的生長(zhǎng)量在根皮苷濃度介于1.5～2.5 mg/L范圍時(shí)，逐漸降低，濃度至2.5 mg/L時(shí)最低，矮化效果最顯著，濃度為3.0 mg/L時(shí)其生長(zhǎng)量又快速增至最大，此時(shí)無(wú)矮化效果；添加根皮苷對(duì)紅粉佳人的恢復(fù)出芽率存在不同程度的抑制作用。根皮苷處理中諾娃的生長(zhǎng)量顯著低于對(duì)照，并且隨根皮苷濃度的增加，生長(zhǎng)量顯著降低，在根皮苷濃度為1.5 mg/L時(shí)明顯的無(wú)矮化效果，當(dāng)根皮苷濃度介于2.0～3.0 mg/L范圍時(shí)，其生長(zhǎng)量隨著濃度升高而顯著降低，當(dāng)濃度為3.0 mg/L時(shí)其生長(zhǎng)量降至最低，此時(shí)矮化效果最顯著，而諾娃的恢復(fù)出芽率隨著根皮苷濃度增加而提高。

表1 不同濃度的根皮苷處理對(duì)2種高山杜鵑組培苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，隨著根皮苷濃度的增加，紅粉佳人的可溶性蛋白含量略微降低，但較對(duì)照均無(wú)顯著性差異；MDA和葉綠素含量以及SOD活性隨根皮苷濃度的增加而提高，其中根皮苷濃度為2.5 mg/L時(shí)的MDA含量和SOD活性顯著高于0～2 mg/L的處理，根皮苷濃度3 mg/L時(shí)，MDA含量和SOD活性下降，但與2.5 mg/L的處理差異不顯著；根皮苷濃度為2 mg/L時(shí)葉綠素含量顯著高于0～1.5 mg/L的處理，之后下降但與2 mg/L的處理差異不顯著。隨著根皮苷濃度的增加，諾娃的可溶性蛋白含量，與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量均隨著根皮苷濃度的升高而增加，當(dāng)根皮苷濃度為3.0 mg/L時(shí)的含量均達(dá)到最高，較對(duì)照及其他處理具有顯著性差異；綜上所述，適合紅粉佳人和諾娃延緩生長(zhǎng)保存的根皮苷濃度分別為2.5和3.0 mg/L。

表2 不同濃度的根皮苷對(duì)2種高山杜鵑組培苗生理指標(biāo)的影響

2.3 B9對(duì)高山杜鵑組培苗延緩生長(zhǎng)的影響

由表3可知，與對(duì)照相比，在B9濃度介于1.0～2.0 mg/L時(shí)，紅粉佳人的生長(zhǎng)量逐漸增加，無(wú)矮化效果；當(dāng)濃度為2.5 mg/L時(shí)，其生長(zhǎng)量最低，矮化效果最顯著，恢復(fù)出芽率隨B9濃度增加而升高。在B9濃度介于2.0～2.5 mg/L時(shí)，諾娃的生長(zhǎng)量逐漸減少且顯著低于對(duì)照，當(dāng)濃度為2.5 mg/L時(shí)，其生長(zhǎng)量達(dá)到最低，矮化效果最顯著，恢復(fù)出芽率隨B9濃度增加而不斷升高。

表3 不同濃度B9對(duì)2種高山杜鵑組培苗生長(zhǎng)的影響

由表4可知，除了B9濃度為1.0與2.0 mg/L之間的差異顯著外，紅粉佳人其他各處理之間的可溶性蛋白含量無(wú)顯著性差異；MDA含量、葉綠素含量及SOD活性隨B9濃度的增加而升高，當(dāng)B9濃度為1.5、2.0和2.5 mg/L時(shí)，其MDA含量和SOD活性無(wú)顯著差異，且均顯著高于對(duì)照，當(dāng)B9濃度為2.5 mg/L時(shí)，葉綠素含量顯著高于對(duì)照。諾娃的可溶性蛋白含量無(wú)明顯提高，不同濃度B9處理與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量隨著B(niǎo)9濃度的升高而增加，濃度為2.5 mg/L時(shí)含量均達(dá)到最高，較對(duì)照均具有顯著性差異。綜上所述，適合紅粉佳人和諾娃延緩生長(zhǎng)保存的B9最佳濃度均為2.5 mg/L。

表4 不同濃度B9對(duì)2種高山杜鵑組培苗生理指標(biāo)的影響

2.4 PP333對(duì)高山杜鵑組培苗延緩生長(zhǎng)的影響

由表5可知，紅粉佳人和諾娃的生長(zhǎng)量在5個(gè)PP333濃度處理下均大幅降低，顯著低于對(duì)照，且各濃度處理下的生長(zhǎng)量之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明PP333對(duì)2種高山杜鵑植株矮化的作用濃度低；而紅粉佳人和諾娃的恢復(fù)出芽率均是隨PP333濃度增加而提高。

表5 不同濃度PP333對(duì)2種高山杜鵑組培苗生長(zhǎng)的影響

由表6可知，隨著PP333濃度的增加，紅粉佳人的可溶性蛋白含量有所下降，但各處理之間與對(duì)照無(wú)顯著性差異；MDA含量、SOD活性均隨著PP333濃度的增加而提高，均在濃度為2.5 mg/L時(shí)達(dá)到最高，較對(duì)照差異顯著；葉綠素含量在1.0～1.5、2.0～2.5 mg/L這2個(gè)濃度梯度處理下增加，在濃度為2.5 mg/L達(dá)到最高。隨著PP333濃度的增加，諾娃的可溶性蛋白含量與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量均隨著PP333濃度的升高呈現(xiàn)波動(dòng)上升的變化趨勢(shì)，在濃度為1.0 mg/L時(shí)達(dá)到最高，較對(duì)照均具有顯著性差異。綜上所述，紅粉佳人最佳的PP333處理濃度為2.5 mg/L，諾娃最佳的PP333處理濃度為1.0 mg/L。

表6 不同濃度PP333對(duì)2種高山杜鵑組培苗生理指標(biāo)的影響

3 結(jié)論與討論

2種高山杜鵑在延緩生長(zhǎng)保存期間，根皮苷、B9、PP333均能明顯抑制杜鵑組培苗的生長(zhǎng)，在對(duì)照及各濃度處理間，可溶性蛋白含量無(wú)顯著差異，而與對(duì)照相比，SOD活性、 MDA、葉綠素含量呈現(xiàn)一定的差異性變化，其中，SOD活性、葉綠素含量隨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加而提高，且各個(gè)處理之間存在顯著差異。延緩生長(zhǎng)保存的組培苗轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基后當(dāng)代即可恢復(fù)生長(zhǎng)。本研究篩選出紅粉佳人最適宜的3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度為根皮苷2.5 mg/L、B92.5 mg/L、PP3332.5 mg/L；諾娃最適宜的濃度為根皮苷3.0 mg/L、B92.5 mg/L，PP3331.0 mg/L，且3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)諾娃的處理效果明顯優(yōu)于對(duì)紅粉佳人。

延緩生長(zhǎng)保存法可以避免頻繁繼代造成污染或引發(fā)種質(zhì)變異，從而有效地保證種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性，達(dá)到植物種質(zhì)資源中期保存目的［18］。向培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)延緩劑是植物組織培養(yǎng)物緩慢生長(zhǎng)保存的有效方法［19］。植物生長(zhǎng)延緩劑是通過(guò)抑制赤霉素的生物合成來(lái)抑制植物頂端分生組織的生長(zhǎng)，從而延緩植物的生長(zhǎng)［20］。研究表明，調(diào)整培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)延緩劑的種類(lèi)和比例，不僅能延長(zhǎng)培養(yǎng)物在試管中的保存時(shí)間，而且能提高試管苗的素質(zhì)和移植成活率。培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)延緩劑，可達(dá)到延緩生長(zhǎng)、延長(zhǎng)保存時(shí)間的目的，方法簡(jiǎn)單，每隔半年以上轉(zhuǎn)接1次可實(shí)現(xiàn)一定時(shí)間的保存，但在實(shí)際工作中，針對(duì)不同品種的試管苗，不同植物生長(zhǎng)延緩劑或抑制劑的效果也會(huì)有所差異。同一種抑制劑應(yīng)用在不同的植物中，效果也不一樣。

根皮苷、B9、PP333等作為高效、低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在試管苗的延緩生長(zhǎng)保存中效果較好且應(yīng)用比較廣泛。但不同生長(zhǎng)延緩劑對(duì)不同種類(lèi)試管苗的抑制作用有所不同，顧地周等［17］采用添加根皮苷的培養(yǎng)基進(jìn)行杜鵑組培苗的延緩保存，研究表明：在試管內(nèi)采取延緩生長(zhǎng)法保存牛皮杜鵑叢生芽團(tuán)是切實(shí)可行的。趙喜亭等［18］研究表明PP333、B9均可延緩懷山藥試管苗的生長(zhǎng)，PP333的保存效果優(yōu)于B9。艾辛等［21］研究表明：在MS培養(yǎng)基中添加4.80 mg/L PP333時(shí)，馬鈴薯脫毒試管苗保存時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)到300 d。王家福等［22］在枇杷種質(zhì)資源離體保存試驗(yàn)中證明，濃度介于2～5 mg/L的PP333有抑制枇杷試管苗生長(zhǎng)的作用。董志君等［23］研究表明：施用PP333可有效矮化芍藥，以上研究結(jié)果均與本研究試驗(yàn)結(jié)論一致。

本研究通過(guò)對(duì)2種高山杜鵑組培苗生理指標(biāo)的測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在延緩高山杜鵑組培苗生長(zhǎng)的同時(shí)，也提高了高山杜鵑滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和抗氧化酶的活性，并增強(qiáng)其抗逆性，與朱茂成等［24］對(duì)米老排幼苗、馮斗等［25］對(duì)甜高粱幼苗的研究結(jié)果一致。但目前關(guān)于高山杜鵑方面的相關(guān)研究仍較少。