高效液相色譜法測定半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中鹽酸小檗堿的含量*

閆麗莉，宋小雪，陳忠新，張文娓，田 明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

國家大力倡導(dǎo)對古代經(jīng)典名方的研究，為了響應(yīng)國家號召，對經(jīng)典名方半夏瀉心湯進(jìn)行現(xiàn)代工藝研究[1]。半夏瀉心湯為我國古代傳統(tǒng)經(jīng)典名方，同時也為國家首批下發(fā)的100個經(jīng)典名方目錄之一，出自于東漢時期著名醫(yī)師大家張仲景的《傷寒論》，經(jīng)幾代人驗(yàn)證療效確切，且應(yīng)用十分廣泛，對急慢性胃腸炎有很好的治療效果[2-4]，本文對半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行測定，有利于進(jìn)一步加強(qiáng)對物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制，同時也為半夏瀉心湯的現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)研究奠定了基礎(chǔ)[5-7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Thermo-Sciencetific Ultimate 3000型高效液相色譜儀（Thermo公司）；FA2004型電子分析天平（力辰科技有限公司）；MP5200H型超聲波清洗機(jī)（陜西鵬展科技有限公司）。

1.2 藥材和試劑

乙腈（色譜純中國Dikma公司）；純化水；KH2PO4（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；十二烷基硫酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；H3PO4（AR天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；110715-201810鹽酸小檗堿（中國藥品生物制品檢定所）；半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)（自制）。

1.3 色譜條件的確定

選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動相為乙腈-0.05moL·L-1KH2PO4溶液（50∶50）（每50mL中加十二烷基硫酸鈉0.2g，用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至4.0）；流速1mL·min-1，檢測波長為345nm[8]。

1.4 對照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含有65μg的溶液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品提取方法的考察

2.1.1 提取方法的考察與結(jié)果分析 稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.25g，共3份，分別置于50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶劑20mL，密塞，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）10、20、30min，取出，搖勻，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状?鹽酸（100∶1）溶劑溶解，定容至10mL容量瓶中，即得。結(jié)果見表1。

表1 供試品提取方法結(jié)果Tab.1 Result table of extraction methods of samples

由表1可知，超聲時間在10～30min時，測定的鹽酸小檗堿含量的RSD值為1.16%，為確保充分提取出半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中鹽酸小檗堿的含量，故將超聲時間確定為20min。

2.1.2 供試品提取方法的確定 取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.25g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶劑20mL，密塞，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）20min，取出，放冷，濾過，蒸干，用甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶劑定溶于10mL容量瓶中，即得。

2.2 專屬性試驗(yàn)

2.2.1 供試品溶液制備 同2.1.2項(xiàng)下處理方法。

2.2.2 對照品溶液制備 同2.1項(xiàng)下對照品制備方法。

2.2.3 陰性對照溶液制備 稱取處方中除黃連外的藥材（共計(jì)80g），按實(shí)驗(yàn)前期半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)確定的最佳制備工藝，制備出缺黃連的物質(zhì)基準(zhǔn)，按2.1.2項(xiàng)下方法制備黃連陰性對照溶液。

2.2.4 試驗(yàn)方法 將2.2.1、2.2.2、2.2.3項(xiàng)下的溶液分別用0.45μm有機(jī)微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進(jìn)樣10μL，依照1.3色譜條件測定，并記錄峰面積，專屬性考察結(jié)果表見表2，液相色譜圖見圖1。

表2 專屬性考察結(jié)果Tab.2 Results of specificity investigation

圖1 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram

由表2及圖1可知，鹽酸小檗堿的出峰時間約為9.5min，在此標(biāo)準(zhǔn)品峰相近的保留時間內(nèi)，陰性樣品干擾峰僅有一個，測得峰面積為0.7328，占供試品峰面積的2.2%，陰性樣品對鹽酸小檗堿的檢測影響較小，試驗(yàn)方法有效。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的確定

取2.2.2項(xiàng)下鹽酸小檗堿對照品溶液適量，經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，按照下表所示體積分別進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果見表3，線性圖見圖2。

表3 線性關(guān)系考察Tab.3 Investigation table of linear relations

圖2 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品線性圖Fig.2 Linear diagram of standard berberine hydrochloride

由表3、圖2可知，以含量及峰面積為橫縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.26～1.04μg之間呈良好線性關(guān)系，得回歸方程為∶Y=61.583X-0.9668，R2=0.999。

2.4 精密度試驗(yàn)

取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.25g，精密稱定，照2.1.2項(xiàng)下的處理方法制成物質(zhì)基準(zhǔn)的供試品溶液，取同一供試品，儀器的程序設(shè)成自動進(jìn)樣10μL，接連測定6次，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算6組數(shù)據(jù)的RSD值。結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Precision test results

由表4可知，以鹽酸小檗堿峰面積作為測定指標(biāo)，RSD值為1.08%（RSD＜3%），表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份物質(zhì)基準(zhǔn)各0.25g，精密稱定，照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，儀器程序設(shè)成自動進(jìn)樣，每次10μL，測定含量及RSD值，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Repeatability test results

由表5可知，重復(fù)性測定6批樣品含量RSD值為1.35%（RSD＜5%），表明該測定方法重復(fù)良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.25g，按2.1.2項(xiàng)下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機(jī)微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置序列及儀器方法，每間隔2h自動進(jìn)樣10μL，連續(xù)監(jiān)測12h內(nèi)鹽酸小檗堿含量情況，計(jì)算RSD值。結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Stability test results

由表6可知，12h內(nèi)所測定鹽酸小檗堿含量較穩(wěn)定，RSD值為0.98%（＜3%），說明該處理方法得到的供試品溶液在12h內(nèi)測定均穩(wěn)定。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.12g，共6份，分別加入0.25mg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液1mL，照2.1.2項(xiàng)下的方法制備半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)的供試品溶液，儀器設(shè)置成自動進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，測定回收率。結(jié)果見表7。

表7 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Test results of sampling recovery

由表7可知，6批次的供試品回收率均在95%～105%之間，表明供試品處理方法加樣回收率符合要求，準(zhǔn)確穩(wěn)定。

2.8 15批樣品含量測定

精密稱取15批次半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)各0.25g，按2.1.2項(xiàng)下方法處理得到供試品溶液，分別用0.45μm有機(jī)微孔濾膜濾過至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置每次自動進(jìn)樣10μL，依照1.3色譜條件測定其含量及RSD值，結(jié)果見表8。

表8 15批樣品含量測定結(jié)果Tab.8 Content determination results of 15 batches of samples

由表8可知，考慮到由于飲片的多批次及產(chǎn)地的不同，導(dǎo)致制備的15批半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中鹽酸小檗堿含量的差異，測定的15批物質(zhì)基準(zhǔn)的鹽酸小檗堿每劑含量在34.61～54.63mg之間，其質(zhì)量離散度較小，均在均值的70%～130%合理波動范圍之間，最終確定半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)的鹽酸小檗堿每劑含量范圍為33.12～61.50mg。根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求》的相關(guān)要求，“含量測定的波動范圍一般不超過均值的70%～130%，合理確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)質(zhì)控項(xiàng)目質(zhì)量要求上下限?！痹摲椒ㄖ宣}酸小檗堿含量范圍的確定與此要求相符。

3 結(jié)論

通過高效液相色譜儀對半夏瀉心湯物質(zhì)基準(zhǔn)中鹽酸小檗堿含量進(jìn)行測定，利用專屬性、線性范圍、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收等方法學(xué)考察確定本測定方法的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，為經(jīng)典名方的開發(fā)與利用做鋪墊，很好的促進(jìn)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展[9,10]。