MiR-129-5p靶向HMGB1抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移

張懷斌，楊國清，梁文強(qiáng)，謝犇，王勇平,2

0 引言

骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要發(fā)病于骨骼快速增長(zhǎng)的兒童和青少年，具有高度的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，容易在發(fā)病早期和術(shù)后產(chǎn)生血行轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅兒童和青少年的健康與生命[1]。臨床上，OS的治療通常是多種治療方式相結(jié)合，包括手術(shù)、化療和放療，雖然輔助化療能顯著提高OS患者的生存率[2]，由于OS惡性程度高、預(yù)后不良、容易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此研究其發(fā)病機(jī)制，從而確定有效治療方法是OS目前研究的重要方向。

MicroRNA（miRNA）是一種進(jìn)化保守的非編碼單鏈小分子，通過結(jié)合靶點(diǎn)的3’UTR（untranslation region,UTR）區(qū)調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯阻塞[3-5]。miRNA在生理和病理?xiàng)l件下都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，miRNA的異常表達(dá)通過調(diào)節(jié)癌基因或腫瘤抑制因子的表達(dá)參與癌癥的進(jìn)展[6]。研究顯示miR-129-5p參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等[7-10]。高遷移率族蛋白B1基因（HMGB1）位于染色體13q12，其編碼的蛋白質(zhì)具有高度保守的結(jié)構(gòu)域[11-12]，在多種腫瘤中高表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增強(qiáng)腫瘤化療敏感度[13-14]；因此，本研究擬通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-129-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響及其對(duì)HMGB1的調(diào)控作用，從而為OS的分子靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、Saos-2、成骨細(xì)胞hFOB1.19、H-DMEM、McCoy,s5A、DMEM/F12不完全培養(yǎng)基、OPTI無血清培養(yǎng)基、PCR引物及PCR試劑盒、Western blot上樣蛋白Marker、PVDF膜、兔抗人GAPDH抗體、羊抗兔HRP、Transwell小室和CCK-8試劑盒均購自武漢Servicebio公司，胎牛血清購自上海HAKATA公司。miR-129-5p抑制物、模擬物及實(shí)驗(yàn)相關(guān)質(zhì)粒由上海艾博思生物科技有限公司合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 6000購自上海艾博思生物科技有限公司，兔抗人HMGB1抗體購自上海Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

骨肉瘤細(xì)胞MG-63、Saos-2分別培養(yǎng)在含10%FBS的H-DMEM和McCoy,s5A培養(yǎng)液中，成骨細(xì)胞hFOB1.19用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有1%雙抗（鏈霉素100 μg/ml+青霉素100 U/ml），培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。每隔3 d進(jìn)行一次換液或常規(guī)傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63、Saos-2細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照試劑說明書進(jìn)行，根據(jù)轉(zhuǎn)染的目的基因不同進(jìn)行如下分組：miR-129-5p inhibitor組、miR-129-5p mimic組、溶劑為NC序列陰性對(duì)照組（NC組）及空白對(duì)照組。將配好的轉(zhuǎn)染液加入各孔細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱中，OPTI無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

經(jīng)TargetScan Human7.2檢測(cè)miR-129-5p與HMGB1基因存在結(jié)合位點(diǎn)，上海艾博思生物科技有限公司構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒（HMGB1-WT/HMGB1-Mut）。將細(xì)胞接種于48孔板中，培養(yǎng)至融合度70%，使用Lipofectamine 6000試劑將HMGB1-WT、HMGB1-Mut與miR-129-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染，按照試劑使用說明，轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定熒光素酶活性。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

用TRIzol試劑分別提取骨肉瘤細(xì)胞MG-63、Saos-2和成骨細(xì)胞hFOB1.19及轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBR Green Master（Rox）試劑進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增條件：95℃ 3 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)

給骨肉瘤細(xì)胞MG-63、Saos-2和成骨細(xì)胞hFOB1.19以及轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞中加入蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶的封閉1 h。加入稀釋后的兔抗人HMGB1單克隆抗體（1:800）和兔抗人GAPDH多克隆抗體（1:1000），4℃孵育過夜，再用稀釋后的羊抗兔IgG-HRP（1:2000）室溫孵育1 h。TBST洗膜，采用ECL顯色并分析條帶，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的骨肉瘤細(xì)胞，制成濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞懸液，按100 μl每孔接種于96孔板。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔細(xì)胞加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450 nm處的吸光度值（OD）。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞豐度達(dá)到9 0%時(shí)，用RPMI 1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后以載玻片作依靠，用移液槍槍頭在每孔中心軸進(jìn)行劃痕并拍照（0 h），繼續(xù)培養(yǎng)并每24 h拍照，培養(yǎng)箱條件37℃、5%CO2。

1.9 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的骨肉瘤細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，用BSA無血清培養(yǎng)基重懸，制備濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞懸液，取100 μl加入Transwell小室上室，下室每孔加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl，37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，移去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦凈上層未遷移的細(xì)胞，PBS洗3次，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞情況并拍照，Image J分析軟件計(jì)數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0和GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組之間定量資料用t檢驗(yàn)，多組定量資料間的比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，與成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，miR-129-5p在骨肉瘤細(xì)胞Saos-2（P=0.0010）和MG-63（P=0.0028）中的表達(dá)量有不同程度降低，見圖1。

圖1 miR-129-5p在不同骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of miR-129-5p in different cell lines

2.2 HMGB1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，與成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，HMGB1在骨肉瘤細(xì)胞Saos-2（P=0.0152）和MG-63（P=0.0199）中的表達(dá)呈不同程度的升高，見圖2。

圖2 HMGB1在不同骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況Figure 2 Expression of HMGB1 in different osteosarcoma cells

2.3 轉(zhuǎn)染miR-129-5p抑制物和模擬物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)的影響

MG-63、Saos-2細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic、miR-129-5p inhibitor后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示：與NC組相比，miR-129-5p mimic組細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)量顯著增加（P=0.0349），見圖3A；miR-129-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)量顯著降低（P=0.0152），見圖3B。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物(A)和抑制物(B)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)的影響Figure 3 Effects of transfection of miR-129-5p mimic(A) and inhibitor(B) on miR-129-5p expression in osteosarcoma cells

2.4 過表達(dá)miR-129-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，在MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic后，其增殖能力受到明顯抑制，與NC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0060），見圖4A；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic后，細(xì)胞遷移能力降低，與NC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0347），見圖4B，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)得出相同的結(jié)論（P=0.0034），見圖4C。

圖4 CCK-8法(A)、劃痕實(shí)驗(yàn)(B)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(C)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic對(duì)MG-63細(xì)胞增殖和遷移的影響Figure 4 Effects of miR-129-5p mimic transfection on proliferation and migration of MG-63 cells detected by CCK-8 assay(A),scratch assay(B) and Transwell migration assay(C)

2.5 抑制miR-129-5p促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，在Saos-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p inhibitor后，其增殖能力提高，與NC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0023），見圖5A；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在Saos-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p inhibitor后，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，與NC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0348），見圖5B，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)得出相同的結(jié)論（P=0.025），見圖5C。

圖5 CCK-8法(A)、劃痕實(shí)驗(yàn)(B)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(C)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-129-5p inhibitor對(duì)Saos-2細(xì)胞增殖和遷移的影響Figure 5 Effects of miR-129-5p inhibitor transfection on proliferation and migration of Saos-2 cells detected by CCK-8 assay(A),scratch assay(B) and Transwell migration assay(C)

2.6 HMGB1基因是miR-129-5p的下游靶點(diǎn)

根據(jù)生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-129-5p和HMGB1基因存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖6A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于mimiccontrol轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，miR-129-5p mimic轉(zhuǎn)染能下調(diào)野生型HMGB1-WT質(zhì)粒組的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0429），見圖6B；而突變型HMGB1-Mut質(zhì)粒組的熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖6B，提示HMGB1基因可能是miR-129-5p的下游作用靶點(diǎn)。

MG-63、Saos-2細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic、miR-129-5p inhibitor后，Western blot結(jié)果表明：miR-129-5p mimic組細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)量降低（P=0.0298），見圖6C；miR-129-5p inhibitor組細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)量顯著升高（P=0.0432），見圖6D，結(jié)果說明miR-129-5p與HMGB1基因之間存在靶向作用關(guān)系。

圖6 miR-129-5p與HMGB1基因的靶向關(guān)系Figure 6 Targeting relationship between miR-129-5p and HMGB1 gene

3 討論

miR-129-5p屬于miR-129家族，研究表明，miR-129-5p參與乳腺癌、前列腺癌、胃癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[7-10]，除了參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程，miR-129-5p也被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡、遷移和自噬等[15-17]，還具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要功能[17-18]。Luan等[7]研究顯示，通過SOX4/EZH2復(fù)合物介導(dǎo)的啟動(dòng)子H3K27me3修飾，miR-129-5p和SOX4相互調(diào)節(jié)影響乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和多藥耐受。去甲斑蟊素可能通過抑制miR-129-5p上調(diào)Beclin-1，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞自噬、死亡和細(xì)胞增殖停滯[8]。另有研究[9]表明，miR-129-5p通過靶向IL-8參與胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程。Tan等[10]研究顯示miR-129-5p通過靶向轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子YAP和TAZ抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和存活。過表達(dá)miR-129-5p可增強(qiáng)MCF-7/ADM細(xì)胞對(duì)多柔比星、長(zhǎng)春新堿的敏感度[18]，還可直接靶向抑制脂肪前體細(xì)胞因子1（deltalike1 homologue,DLK1）基因影響非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的耐藥[17]。以上研究結(jié)果表明，miR-129-5p能夠通過靶向不同基因發(fā)揮抑癌或促癌基因的作用。本研究首先通過RT-PCR分析miR-129-5p在不同骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于健康人成骨細(xì)胞，這提示miR-129-5p在OS中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究選取miR-129-5p表達(dá)量較低的MG-63細(xì)胞和較高的Saos-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染其模擬物和抑制物，以探討該分子對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物后MG-63細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)量顯著升高，且MG-63細(xì)胞增殖和遷移能力受到顯著抑制；轉(zhuǎn)染miR-129-5p抑制物后Saos-2細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)量顯著降低，且Saos-2細(xì)胞增殖和遷移能力得到增強(qiáng)，提示miR-129-5p在OS中可能起抑癌作用。

本研究還通過Western blot實(shí)驗(yàn)研究不同骨肉瘤細(xì)胞系中HMGB1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于健康人成骨細(xì)胞，表明HMGB1高表達(dá)可能是導(dǎo)致OS的原因，且過表達(dá)和抑制miR-129-5p會(huì)引起骨肉瘤細(xì)胞中HMGB1表達(dá)的降低和增高。HMGB1編碼的蛋白質(zhì)是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞核的高度保守的核蛋白，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的功能。HMGB1高表達(dá)與多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[19-21]。Ladoire等[22]證實(shí)HMGB1在乳腺癌中表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。Chen等[23]研究顯示，瞬時(shí)敲低HMGB1可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，誘導(dǎo)S期阻滯，抑制其體外遷移和侵襲。Liu等[24]研究表明，miR-181b能夠靶向HMGB1-3’UTR抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-129-5p和HMGB1基因存在結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HMGB1基因可能是miR-129-5p的下游作用靶點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物后MG-63細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)量降低，而轉(zhuǎn)染miR-129-5p抑制物后Saos-2細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)量升高。

綜上所述，miR-129-5p在骨肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，可以減弱骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，降低HMGB1的表達(dá)，提示miR-129-5p在骨肉瘤中扮演抑癌基因的角色，其作用機(jī)制可能是通過抑制HMGB1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。此外，本研究缺乏HMGB1基因過表達(dá)、敲除實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，后續(xù)將完善該部分實(shí)驗(yàn)并開展動(dòng)物體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)，以期深入驗(yàn)證miR-129-5p和HMGB1在OS中的功能和作用機(jī)制。