植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁愈傷組織誘導(dǎo)、組培苗生根的影響

劉濟明，張 蘭，武夢瑤a，彭 靚，吳婷婷，田 秀，廖小鋒

（1.貴州大學(xué) a.林學(xué)院；b.森林生態(tài)研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州科學(xué)院 山地資源研究所，貴州 貴陽 550025）

米槁Cinnamomum migaoH.W.Li 系樟科Lauraceae 樟屬植物，其干燥成熟果實大果木姜子是貴州特色藥材[1-2]，貴州民間常用于治療腹脹、腹痛、暈車嘔吐等疾病。米槁果實能夠和其他藥材制成理氣活血滴丸，在臨床上對冠心病、心絞痛患者有明顯的緩解作用[3-4]。但目前米槁資源稀缺，主要分布于滇黔桂交界地區(qū)[5]，長期以來對米槁進行不合理的亂砍濫伐，長期只收不種、不保護的惡性做法，導(dǎo)致米槁果實資源匱乏，藥源緊缺[6]。由于米槁果實的藥用價值使它在市場上的需求量極大，野生資源卻極其稀缺，所以人工栽培是解決供需矛盾的關(guān)鍵手段。無性繁殖對于快速繁殖苗木具有很好的應(yīng)用前景，能夠快速獲得遺傳基因一致的苗木，是優(yōu)良種源繁殖的關(guān)鍵手段，目前扦插和組培技術(shù)最為成熟。本課題組之前對米槁扦插繁殖技術(shù)進行了研究，米槁屬難生根樹種，在米槁扦插繁殖過程中仍存在難生根的現(xiàn)象，且扦插成功需要插穗快速形成不定根，否則插穗就會因長時間暴露在惡劣環(huán)境中或者遭遇病蟲害而導(dǎo)致組織壞死；對米槁進行扦插發(fā)現(xiàn)在插穗生根過程中存在對生根起抑制作用的物質(zhì)[7-8]。組培技術(shù)是否能夠克服上述障礙，快速獲得大量米槁優(yōu)良苗木，值得探索。植物組織培養(yǎng)的研究，始于1920年德國植物學(xué)家Haberlandt 首次提出細(xì)胞具有全能性的概念，從20 世紀(jì)60年代至今一直處于迅速發(fā)展的階段[9]。目前，已經(jīng)制定了人參、三七、柴胡、甘草、丹參、雷公藤和許多種藥用植物的不定根培養(yǎng)體系，且已經(jīng)成功地應(yīng)用于大規(guī)模培養(yǎng)[10]。植物生長調(diào)節(jié)劑是指人工合成的具有與植物激素類似生理效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，比天然植物激素有更高的活性。促進植物生根的植物生長調(diào)節(jié)劑有IAA、IBA、NAA、2,4-D等[11]，但不同植物所需要的種類與質(zhì)量濃度和處理時間都存在一定差異，沒有固定的用法和用量[12]。不同植物生長調(diào)節(jié)劑對墨脫花椒扦插生根的研究發(fā)現(xiàn)，NAA 有利于其插穗不定根的形成，IBA 有利于不定根的伸長，二者混合使用效果更佳[13]。本研究通過組織培養(yǎng)研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對米槁愈傷組織誘導(dǎo)、組培苗生根的影響，探究米槁愈傷組織誘導(dǎo)、組培苗生根的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑和質(zhì)量濃度配比選擇，篩選出米槁愈傷組織誘導(dǎo)、組培苗生根的最佳培養(yǎng)基，提高米槁的幼苗成活率，有效地保護米槁資源[7]，為米槁工廠化育苗提供理論依據(jù)，豐富米槁的無性繁殖體系，加速米槁苗木的生產(chǎn)，滿足市場的需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

愈傷組織誘導(dǎo)材料采自貴州大學(xué)林學(xué)院播種栽培的2年生優(yōu)質(zhì)米槁植株，選取當(dāng)年生生長健壯、未木質(zhì)化或半木質(zhì)化的葉片為外植體；組培苗生根材料選用米槁帶芽莖段誘導(dǎo)的不定芽。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

參考樟科樟屬其他樹種組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，本試驗誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖選用MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)選用1/2MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。分別加入30 g/L 蔗糖、6.5～7.0 g/L 瓊脂、不同種類和不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑和不同質(zhì)量濃度的AC 進行培養(yǎng)基的配制，培養(yǎng)基pH 值為5.8。生根培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，每日光照時間為12～14 h，日光燈光源，100%光照強度1 500～2 000 lx。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，暗培養(yǎng)。

1.2.2 消毒劑與植物生長調(diào)節(jié)劑種類

75%酒精+0.1% HgCl2+7 min為最佳消毒方式，其外植體污染率最低。植物生長調(diào)節(jié)劑種類選擇6-BA、IBA、NAA 及2,4-D。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 米槁愈傷組織誘導(dǎo)試驗設(shè)計

米槁在2,4-D 與6-BA、NAA 組合處理下愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，2,4-D 質(zhì)量濃度為1.0、3.0、5.0 mg/L，6-BA 質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0 mg/L，NAA 質(zhì)量濃度為0.1、0.3、0.5 mg/L，采用3 因素3 水平隨機設(shè)計，具體見表1。將米槁葉片消毒好后接種至不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合的MS培養(yǎng)基中，每個處理接種20 瓶，每瓶1～2 個葉片，重復(fù)3 次，30 d 后統(tǒng)計結(jié)果。

表1 米槁愈傷組織誘導(dǎo)試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of C.migao callus induction

1.3.2 米槁組培苗生根培養(yǎng)試驗設(shè)計

參考其他樟科樟屬植物的組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)基配方，選用NAA 與IBA 對米槁不定芽進行生根培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的AC。NAA 質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0 mg/L，IBA 質(zhì)量濃度為0.1、1.0、3.0 mg/L，AC 質(zhì)量濃度為0、0.2、0.5 g/L，采用3 因素3 水平隨機設(shè)計，試驗設(shè)計見表2。將米槁不定芽消毒好后接種至不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合的1/2MS 培養(yǎng)基中，每個處理接種20 瓶，每瓶1～2 個不定芽，重復(fù)3 次。

表2 米槁組培苗生根試驗設(shè)計Table 2 Experimental design of C.migao culture seedling rooting

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進行初期統(tǒng)計與匯總，應(yīng)用SPSS 25 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平設(shè)定為α=0.05 和α=0.01，采用Duncan’s 法進行多重比較；采用單因素方差分析、多因素方差分析不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁愈傷組織誘導(dǎo)率、組培苗生根率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表3。由表3可知，處理6、8 無顯著差異，處理2 除與1、5、7、9 處理有顯著差異之外，其余處理均無顯著差異；除處理7和9 與處理2 有極顯著差別外，其他處理下愈傷組織誘導(dǎo)率并無極顯著差別。其中平均誘導(dǎo)率最高的組合為處理2，誘導(dǎo)率達到了81.25%，其次誘導(dǎo)率較高的為處理3，誘導(dǎo)率達到了80.00%。進一步對不同質(zhì)量濃度的2,4-D、6-BA、NAA 做方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，不同質(zhì)量濃度的2,4-D 對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），說明不同質(zhì)量濃度的2,4-D 對愈傷組織誘導(dǎo)均存在差異性，隨著2,4-D 質(zhì)量濃度的升高，其誘導(dǎo)率降低，且質(zhì)量濃度越大對愈傷組織誘導(dǎo)的抑制作用越明顯。而不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA 對愈傷組織誘導(dǎo)率無明顯差異，6-BA 和NAA 隨著質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)出誘導(dǎo)率升高再降低的情況，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為3.0 mg/L 和NAA質(zhì)量濃度為0.3 mg/L 時，其誘導(dǎo)率最高，所以中質(zhì)量濃度的6-BA 和NAA 適合米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。綜上可知，采用此正交試驗設(shè)計，不同質(zhì)量濃度的2,4-D 對米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響最大，最適合米槁葉片愈傷組織生長的培養(yǎng)基組合為MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，在此植物生長調(diào)節(jié)劑組合質(zhì)量濃度下誘導(dǎo)率最高，達到了81.25%，且在此組合培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織顏色稍偏淺綠色，容易松散，不緊密，細(xì)胞排列疏松，脫分化程度較高（圖1）。

圖1 米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)Fig.1 The callus induction of C.migao leaves

表3 不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁愈傷組織誘導(dǎo)的試驗結(jié)果?Table 3 The test results of the callus induction of C.migao with different kinds and concentrations of plant growth regulators

表4 不同質(zhì)量濃度的2,4-D、6-BA、NAA 對米槁愈傷組織誘導(dǎo)影響的方差分析Table 4 The variance analysis of effects of different 2,4-D,6-BA,NAA concentrations on the callus induction of C.migao

為了解不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑之間對米槁葉片愈傷組織的交互作用，對其做多因素方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，2,4-D 對米槁葉片愈傷組織的誘導(dǎo)存在極顯著差異（P＜0.01），6-BA 對愈傷組織的誘導(dǎo)存在顯著差異（P＜0.05），NAA 對愈傷組織誘導(dǎo)無明顯差異，說明2,4-D 和6-BA 是影響米槁愈傷組織誘導(dǎo)的兩個主要因素。2,4-D 和NAA，NAA 和6-BA、2,4-D，6-BA 和NAA的交互作用存在極顯著差異，而2,4-D和6-BA的交互作用存在顯著差異。

表5 不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁愈傷組織誘導(dǎo)影響的方差分析?Table 5 The variance analysis of effects of different plant growth regulators on the callus induction of C.migao

2.2 不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁組培苗生根的影響

組培苗生根材料為米槁帶芽莖段誘導(dǎo)的不定芽，其增殖情況見圖2。將消毒好的米槁不定芽外植體接種于不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合的1/2MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大概40 d 后長出根系，觀察并記錄根系生長情況，結(jié)果見表6。由表6可知，處理1、3、5、7、9 米槁不定芽生根率無明顯差異，處理4 與所有組別處理都存在顯著差異，處理2、6、8 之間無顯著差異。處理1、2、3、5、6、7、9 之間無極顯著差異，處理4 與處理2、6、8、9 存在極顯著差異，其余均無顯著差異。其中平均生根率最高的組合為處理4，達到了72.38%。為進一步了解不同種類及質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁不定芽組培苗生根的影響，對不同質(zhì)量濃度的NAA、IBA、AC 做方差分析，結(jié)果見表7。由表7可知，不同質(zhì)量濃度的IBA 和AC 對米槁不定芽組培苗生根均有顯著差異（P＜0.05），不同質(zhì)量濃度NAA 處理對米槁組培苗生根無顯著性差異，說明IBA 和AC 是米槁組培苗生根的重要因素。隨著IBA 質(zhì)量濃度的升高，生根率呈現(xiàn)先降低后升高的情況，但并沒有超過質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的生根率；NAA 和AC 對米槁組培苗生根的影響均為先上升再下降，因此NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、IBA 為0.1 mg/L、AC 為0.2 g/L 時，米槁不定芽組培苗的生根率最高。綜上所述，采用此正交試驗設(shè)計，最適合米槁不定芽組培苗生根的培養(yǎng)基組合是1/2 MS + NAA 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L + AC 0.2 g/L，在此組合條件下平均生根率最高，達到了72.38%；且在此組合處理下組培苗根系生長狀況最好，生根較早，根系繁密，有須根，根長較長；而其他處理下生根較晚，根系數(shù)量稀少，根系粗短、粗壯（圖3）。

圖3 米槁組培生根苗Fig.3 Rooting of tissue culture seedlings of C.migao

表6 不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁組培苗生根的影響Table 6 Effects of treatment with different kinds and concentrations of plant growth regulators on the rooting of C.migao

表7 不同質(zhì)量濃度NAA、IBA、AC 對米槁組培苗生根影響的方差分析Table 7 The variance analysis of effects of different NAA,IBA,AC concentrations on the rooting of C.migao

圖2 米槁不定芽增殖Fig.2 Adventitious bud proliferation of C.migao

3 討論與結(jié)論

米槁是我國特有的藥用木本植物，主要分布于我國西南部，在我國已經(jīng)被《中國生物多樣性紅色物種名錄?高等植物卷》列為近危物種，而苗木的缺乏被認(rèn)為是種群退化的重要原因[2]，其藥用價值使得米槁在市場上供不應(yīng)求，而野生資源又極其匱乏，現(xiàn)已有的米槁扦插繁殖相關(guān)研究能夠一定程度上解決米槁快速繁殖的技術(shù)問題，組織培養(yǎng)能夠縮短植物繁殖周期，提高苗木產(chǎn)量，保護其遺傳穩(wěn)定性[14]。愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽是組織培養(yǎng)中的一個難點，而生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中的一個重要環(huán)節(jié)，組培生根苗的質(zhì)量直接會影響到移栽苗的成活率，進而決定種苗培育的成本，因此為了提高最后移栽成苗的存活率，其愈傷組織誘導(dǎo)和組培苗生根的培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度配比、外植體的選擇都至關(guān)重要[15]。本研究報道了不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)、組培苗生根的影響，2,4-D 和6-BA 是影響愈傷組織誘導(dǎo)的兩個主要因素，其配比和質(zhì)量濃度變化影響著愈傷組織的誘導(dǎo)率；IBA 和AC 是影響組培苗生根的重要因素，其配比和質(zhì)量濃度變化也影響著組培苗的生根率。

每種植物都有獨特的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，外植體的類型以及植物的生長調(diào)節(jié)劑在一定程度上都會影響愈傷組織的形成[16]，而外植體的選擇對愈傷組織的誘導(dǎo)起決定性作用，在以杉木Cunninghamia lanceolata的葉片、莖段、子葉、下胚軸為外植體在MS 培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導(dǎo)時，其外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的能力為葉片＞莖段＞子葉＞下胚軸，且2,4-D 和6-BA 配比直接影響愈傷組織的生長速度和特性[17]。以油茶Camellia oleifera花藥為外植體，植物生長調(diào)節(jié)劑NAA、2,4-D 和6-BA 配合使用可有效誘導(dǎo)愈傷組織的形成，2,4-D 與6-BA 質(zhì)量濃度組合為2.0、0.5 mg/L時誘導(dǎo)效果最佳，且2.0 mg/L 2,4-D 具有明顯的抑菌作用[18]。以樟樹Cinnamonum camphora未成熟的合子胚為外植體，分別在添加了2,4-D 和6-BA、2,4-D 和NAA 的MS 培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，在添加了2,4-D 和6-BA 的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)效果更好[19]；以樟樹葉片為外植體時最佳誘導(dǎo)生長調(diào)節(jié)劑組合為NAA 和6-BA[20]。以山東抗寒香樟葉片為外植體，在MS 培養(yǎng)基上添加6-BA 與2,4-D質(zhì)量濃度配比為1∶4的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，能夠提高誘導(dǎo)率，并且愈傷組織的顏色較淺，表面更濕潤、疏松[21]。植物組織培養(yǎng)中的愈傷組織分化成為不定芽是一個難點，本研究未成功將愈傷組織分化形成不定芽，可能是由于選用的生長調(diào)節(jié)劑6-BA 與NAA 并不適宜愈傷組織分化成芽，也可能是并未找到適宜的質(zhì)量濃度配比。本試驗中選用的植物生長調(diào)節(jié)劑種類有限，后期研究中可進一步擴大其種類的選擇范圍，探究其他植物生長調(diào)節(jié)劑種類對米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。同時，還可研究米槁帶芽莖段、葉柄、根等其他外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的能力。本研究僅局限于研究愈傷組織的誘導(dǎo)率，沒有做質(zhì)量評價，這也有可能是愈傷組織沒有分化成為不定芽的一個原因。愈傷組織的質(zhì)量是其分化為不定芽的一個重要原因，下一步的研究方向不僅是研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑、不同外植體對愈傷組織的影響，還應(yīng)該注重愈傷組織的質(zhì)量評價。

生根培養(yǎng)是米槁成功進行組織培養(yǎng)的決定性環(huán)節(jié)，是不定芽成功煉苗并栽種至基質(zhì)中的關(guān)鍵一步，誘導(dǎo)的植物生根數(shù)量及根系質(zhì)量一定程度上決定著移栽成活率[14]。在生根培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度配比、組培苗材料的質(zhì)量都對生根培養(yǎng)起著關(guān)鍵作用，本研究選擇米槁帶芽莖段誘導(dǎo)的不定芽為生根培養(yǎng)材料，在1/2 MS 培養(yǎng)基上添加不同質(zhì)量濃度的IBA、NAA 和AC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBA 和AC 是影響生根的兩個主要因素。銀白楊Populus alba不定芽誘導(dǎo)生根1/2 MS培養(yǎng)基的生根率明顯高于MS 和WPM 培養(yǎng)基，不同質(zhì)量濃度的IBA 和NAA 都能使銀白楊不定芽生根，且低質(zhì)量濃度更容易生根，IBA 處理生根率高于NAA[12]。在構(gòu)樹Broussonetia papyrifera的組培苗生根培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基生根效果表現(xiàn)為1/2 MS＞1/4 MS＞ MS，NAA 的生根效果優(yōu)于IAA 和IBA，IBA 質(zhì)量濃度增大將會抑制構(gòu)樹的生根，且有落葉及愈傷組織增多的現(xiàn)象[22]。NAA和IBA 均對誘導(dǎo)‘紫玉’紫薇生根有顯著影響，但NAA 處理生根率更高，生根數(shù)更多，根長更長[23]。本研究發(fā)現(xiàn)IBA 是誘導(dǎo)米槁不定芽生根的重要因素，且較低質(zhì)量濃度的IBA 更容易促進生根，這與歐洲花楸Sorbus aucuparia、海南冬青Ilex hainanensisMerr.、桃Prunus persica等植物的研究結(jié)果相似，較高質(zhì)量濃度的IBA 會對組培苗生根起抑制作用，使生根率降低且容易誘導(dǎo)愈傷組織生長[24-26]。AC 在組織培養(yǎng)中可提供黑暗環(huán)境，利于根的誘導(dǎo)和根系生長，防止褐變。在秋子梨Pyrus ussuriensis的生根培養(yǎng)基中加入AC，其組培苗生根率、生根數(shù)和根長都高于未添加AC 的培養(yǎng)基[27]。在對抗風(fēng)桐Pisonia grandis的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加AC，獲得的組培苗移栽成活率更高[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，AC 質(zhì)量濃度的增加可以提高米槁的生根率。可繼續(xù)增加米槁生根培養(yǎng)中AC 的質(zhì)量濃度，對于米槁生根率的變化情況、AC 能否縮短組培苗時間和移栽苗木等做進一步研究；也可研究單一的植物生長調(diào)節(jié)劑對米槁生根的影響、組培苗生根的移栽成活率，為大量繁殖米槁苗木、豐富無菌苗提供技術(shù)支持。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)2,4-D 與6-BA 是影響米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)的兩個主要因素，其配比和質(zhì)量濃度變化影響米槁葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率。低質(zhì)量濃度的2,4-D 更適宜米槁葉片愈傷組織的誘導(dǎo)；質(zhì)量濃度越高，愈傷組織的抑制率越大。IBA和AC 是影響米槁生根率的主要因素，低質(zhì)量濃度IBA、中質(zhì)量濃度NAA 和AC 適合生根培養(yǎng)。采用此正交試驗設(shè)計得出的米槁葉片愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+瓊脂6.5 g/L +蔗糖30 g/L，米槁不定芽最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+AC 0.2 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L。