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    全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜對微生物降解石油烴產(chǎn)物的分析

    2022-02-22 00:38:56曾繁城高鵬飛趙炳巖劉子銘
    吉林化工學院學報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:嗜酸烷烴單胞菌

    劉 虹, 曾繁城,高鵬飛,黃 毅,趙炳巖, 劉子銘

    (1.吉林化工學院 資源與環(huán)境工程學院,吉林 吉林 132022;2.吉林省中實環(huán)保工程開發(fā)有限公司,吉林 長春 130031;3.國家地質(zhì)實驗測試中心,北京 100037)

    全二維氣相色譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography,簡稱GC×GC)是一種能夠?qū)碗s混合物分離的新型技術(shù),于20世紀90年代發(fā)展起來,該技術(shù)能夠把分離機理不同又相互獨立的兩個色譜柱通過調(diào)制器采用串聯(lián)的方式連接成二維氣相色譜柱系統(tǒng),其中,調(diào)制器具有捕集、聚焦和再傳輸?shù)淖饔?與傳統(tǒng)的一維氣相色譜技術(shù)相比,全二維氣相色譜具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)勢[1].目前,該技術(shù)主要被用在石油產(chǎn)品、農(nóng)藥、中藥揮發(fā)油以及煙氣等復雜混合物的分析和研究方面,并且取得了較好的分離效果[2-5].在原油和石油產(chǎn)品研究中,主要用于對其組分的表征[6-8].

    石油是一種復雜的混合物,含有多種烴類(包括正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴等)、萜類、含氮、氧、硫雜原子烴類物質(zhì)等[9].其中,大部分石油烴可被微生物代謝、分解.目前,有關(guān)微生物降解石油烴、修復環(huán)境污染方面的文獻較多[10-11].研究微生物降解石油產(chǎn)物,對了解微生物降解石油機理具有重要的意義.冷凱良等采用色譜、質(zhì)譜、紫外光譜等對微生物降解原油的代謝產(chǎn)物進行了分析,建立了微生物降解原油代謝產(chǎn)物的分析方法,得出微生物降解原油代謝產(chǎn)物主要有乙酸和以棕櫚酸為主的脂肪酸與鼠李糖形成的糖酯類表面活性劑[12].花莉等通過采用GC-MS對居植物柔武士菌(Raoultella planticola)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)降解石油烴機制進行了分析,發(fā)現(xiàn)不同微生物在降解過程中發(fā)揮不同的作用[13].然而,當降解產(chǎn)物中出現(xiàn)不可分辨的復雜混合物UCM(Unresolved Complex Mixtures)時,采用普通的GC不能完全將組分分離并進行詳細的分析.因此,本文采用全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC×GC/TOFMS)對微生物降解石油烴產(chǎn)物進行分析和研究,探索微生物降解石油污染物的機理.以期為新菌種的篩選及降解性能的評價提供理論依據(jù).

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    無機鹽液體培養(yǎng)基(單位:mg/L):(NH4)2SO42000,K2HPO41550,NaH2PO4850,MgCl2·6H2O 100,EDTA 10,F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0,ZnSO4·7H2O 2.0,MnCl2·2H2O 1.0,CaCl2·2H2O 1.0,CoCl2·6H2O 0.4,NaMoO4·2H2O 0.2,CuSO4·5H2O 0.2.

    原油培養(yǎng)基:無機鹽培養(yǎng)基加入柴油.

    主要儀器設(shè)備:LD4-2A醫(yī)用離心機、氣相色譜儀(Agilent7890B)、手提式壓力蒸汽滅菌器、SP-DJ系列垂直凈化工作臺、HZQ-QX全溫振蕩器、二維氣相色譜儀(Agilent7890)、飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent TOF)等.

    1.2 微生物降解石油烴實驗

    1.2.1 實驗菌株

    本實驗用到的降解石油烴的菌株,是前期研究所得.采集松原油田石油污染土壤,以石油烴作為唯一碳源,篩選所得的高效降解石油烴的菌株,經(jīng)16S rDNA鑒定,該菌株為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌.

    1.2.2 微生物降解石油烴產(chǎn)物的提取

    采用前期研究所得的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌作為石油烴降解菌株,進行降解實驗.將菌株接入50 mL LB液體培養(yǎng)基中,于120 r/min,30 ℃下振蕩培養(yǎng)2 d至對數(shù)生長期,將培養(yǎng)液于8 000 r/min離心后,取菌體加入無菌水,制備成菌懸液.取菌懸液5 mL加入100 mL的無機鹽培養(yǎng)液、加入400 mg 0#柴油,其中1個樣品不加菌液作為空白對照,同時做2組平行樣作為對照,加菌培養(yǎng)液OD600約為0.6.以上樣品于120 r/min,30 ℃下振蕩培養(yǎng)5 d.分別加入20 mL正己烷進行萃取.萃取后的有機相經(jīng)無水Na2SO4干燥后,分別采用GC,GC×GC系統(tǒng)測試、分析菌株降解石油烴的產(chǎn)物.

    1.3 一維氣相色譜分析方法

    色譜條件:注入口溫度280 ℃,載氣為氮氣,壓力59.5 kPa,總流量37.7 mL/min;分流比為20.0;采用 Rtx-1 色譜柱,30.0 m×0.25 μm×0.32 mm,流量為1.65 mL/min,初始溫度80 ℃ 下保持3.0 min,然后以8 ℃/min 升溫速率升溫至100 ℃,再按10 ℃/min 速率升溫至200 ℃,按15 ℃/min 速率升溫至280 ℃保持15 min,總程序時間共計35.85 min.柱箱的最大溫度為330 ℃;檢測器溫度為290 ℃;進樣體積采用1 μL.

    1.4 二維氣相色譜分析方法

    1.4.1 GC×GC儀器和操作條件

    GC×GC系統(tǒng)由配有氫火焰離子化檢測器(FID)的Agilent7890氣相色譜儀和冷噴調(diào)制器共同組成.系統(tǒng)使用兩套柱系統(tǒng),具體操作條件詳見表1.采用不分流進樣方式,進樣體積約為1 uL.

    表1 GC×GC系統(tǒng)操作條件表

    1.4.2 飛行時間質(zhì)譜

    飛行時間質(zhì)譜儀為美國Agilent公司的TOF.電子轟擊電離源的電壓為70 Ev,檢測器的電壓為1 850 kV,傳輸線的溫度為300 ℃,離子源的溫度為230 ℃,以每秒100張全譜圖的采集頻率采集質(zhì)量數(shù)范圍在45~700 u的質(zhì)譜數(shù)據(jù).所得數(shù)據(jù)再經(jīng)工作站進一步處理.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 一維氣相色譜分析

    微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴5 d后,所得的培養(yǎng)液見圖1.

    圖1 菌株降解石油烴5 d培養(yǎng)液

    由圖1可以看出,菌株在以石油烴為唯一碳源的培養(yǎng)液中,大量生長、繁殖,培養(yǎng)液由于菌體的生長,變得非常渾濁.對降解5 d的培養(yǎng)液及未降解前的樣品進行提取,采用氣相色譜法進行分析,分析結(jié)果如圖2、3所示.

    t/min圖2 降解前石油烴氣相色譜圖

    t/min圖3 降解5 d后石油烴氣相色譜圖

    圖2、3的色譜圖進行對比分析,并對所得數(shù)據(jù)進行計算得出,微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴5 d后,80%以上的石油烴被降解,大部分石油烴組分被完全降解,部分組分降解不徹底.且在降解后的氣相色譜圖中,出現(xiàn)了不可分辨的復雜混合物UCM,其無法用GC進行分析.因此,進一步采用GC×GC/TOFMS對降解產(chǎn)物進行檢測、分析.

    2.2 二維氣相色譜分析

    微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴5 d后的產(chǎn)物經(jīng)GC×GC/TOFMS分析,所得二維、三維圖譜如圖4、5所示.

    圖4 GC×GC/TOFMS分析菌株降解石油烴產(chǎn)物的二維譜圖

    圖5 全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜分析菌株降解石油烴產(chǎn)物的三維譜圖

    由圖4、5可知,采用GC×GC/TOFMS對微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴產(chǎn)物進行分析,產(chǎn)物中的不可分辨的復雜混合物UCM中的組分被分離、檢測.所檢測到的組分共計1 900多種,主要包括未徹底降解的石油烴組分和菌株降解石油烴的中間產(chǎn)物,對其中的主要組分進行分析,結(jié)果列于表2、3.

    石油烴的組分復雜,主要包括飽和烴類,如直鏈烷烴、支鏈烷烴和環(huán)烷烴等,還有不飽和烴類主要有烯烴、炔烴、單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳烴等[14].由表2中未徹底降解的石油烴組分可知,在好氧條件下,石油烴組分中的大部分C10-C28正構(gòu)烷烴均被嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解.未降解的組分中,最多的是多環(huán)芳烴如1,4,5-三甲基-萘、2,6-二甲基萘、5-甲基-1,2,3,4-四氫-萘、1,2,3,4,5,6,7,8-八氫-蒽、菲等.還有部分支鏈烷烴和環(huán)烷烴,支鏈烷烴有2,6,10,14-四甲基-十七烷、2,6,10-三甲基-十二烷、3-乙基-辛烷、3-甲基-十三烷、2-甲基-5-丙基-壬烷等,環(huán)烷烴有己基-環(huán)己烷、亞乙基-環(huán)戊烷、金剛烷等.這說明,石油烴組分中,鏈長度中等(C10-C24)的正構(gòu)烷烴最容易被微生物降解,菌株降解石油烴組分由易到難的順序為:直鏈烷烴>支鏈烷烴>芳香烴、環(huán)烷烴,這與已有的研究結(jié)論一致[15].

    表2 未徹底降解的石油烴組分

    續(xù)表3

    在好氧條件下,微生物降解石油烴的最終產(chǎn)物通常為CO2、H2O等.在降解過程中,微生物降解不同石油烴組分的途徑各不相同,產(chǎn)生的中間產(chǎn)物也有所差異.由表3列出的嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴的中間產(chǎn)物可以推斷,菌株在有氧條件下,降解石油烴組分的中間產(chǎn)物主要有醇、酮、有機酸及酸酐等.其中,直鏈烷烴如十六烷,在微生物作用下,生成中間產(chǎn)物鯨蠟醇,接著被氧化為十六醛和脂肪酸,脂肪酸被進一步氧化,最終生成CO2和H2O,直鏈烷烴的中間產(chǎn)物有7-十四醇、二十八烷醇、鯨蠟醇、17-硬酯酸等;與直鏈烷烴相比,支鏈烷烴較難被降解,其降解途徑和直鏈烷烴相似,檢測到的中間產(chǎn)物有2-己基-1-十二醇、2-辛基-1-癸醇、2-甲基-1-辛醇等;環(huán)烷烴先被氧化為環(huán)醇,接著形成環(huán)酮,然后被進一步降解,檢測到的中間產(chǎn)物有1-環(huán)己醇、環(huán)辛烷甲醇、3-甲基環(huán)戊醇、環(huán)庚烷甲醇等;芳香烴很難被該菌株降解,烷基芳香烴被氧化成羧酸,芳香烴苯環(huán)被羥基化,隨后進行芳環(huán)裂解,多環(huán)芳烴殘留較多,檢測到的中間產(chǎn)物有間苯二甲酸等.以上結(jié)論與楊麗芹等人的研究結(jié)論一致[16].

    表3 菌株降解石油烴中間產(chǎn)物表

    3 結(jié) 論

    (1)采用GC對微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴進行分析,80%以上的石油烴被降解,降解后的氣相色譜圖中,出現(xiàn)了不可分辨的復雜混合物UCM.

    (2)采用GC×GC/TOFMS對微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解石油烴產(chǎn)物進行分析,產(chǎn)物中不可分辨的復雜混合物UCM中的組分被分離、檢測.檢測結(jié)果表明,石油烴組分中的大部分C10-C28正構(gòu)烷烴被嗜酸寡養(yǎng)單胞菌好氧降解.未降解的組分中,最多的是多環(huán)芳烴,還有部分支鏈烷烴和環(huán)烷烴.

    (3)由檢測結(jié)果推斷嗜酸寡養(yǎng)單胞菌降解不同石油烴組分的途徑為:直鏈烷烴如十六烷在微生物作用下生成中間產(chǎn)物鯨蠟醇,接著被氧化為十六醛和脂肪酸,脂肪酸被進一步氧化,最終生成CO2和H2O;支鏈烷烴的降解途徑和直鏈烷烴相似;環(huán)烷烴先被氧化為環(huán)醇,接著形成環(huán)酮,然后被進一步降解;芳香烴很難被該菌株降解,烷基芳香烴被氧化成羧酸,芳香烴苯環(huán)被羥基化,隨后進行芳環(huán)裂解,多環(huán)芳烴大部分不能被降解.

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