一株反硝化聚磷菌的篩選鑒定及脫氮除磷性能研究

羅 俊，孫 霞,2，劉 揚，張 虎

(1.湖南百舸水利建設(shè)股份有限公司, 湖南 長沙 410007;2.山東江河濕地生態(tài)研究院, 山東 濟南 271100;3.中國水利水電科學(xué)研究院, 北京100080)

0 引言

洞庭湖是我國第二大淡水湖，由于工農(nóng)業(yè)廢水污染、航運、水產(chǎn)養(yǎng)殖等因素，其富營養(yǎng)化問題日漸凸顯。《2018年中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》發(fā)布的淡水環(huán)境狀況表明，洞庭湖為中度營養(yǎng)化狀態(tài)，水質(zhì)為Ⅳ類，主要污染指標(biāo)為總氮、總磷。黃代中等[1]近20年的研究發(fā)現(xiàn)，洞庭湖區(qū)的營養(yǎng)化狀況呈惡化趨勢，特別是東洞庭湖，已由中營養(yǎng)化過渡為輕度富營養(yǎng)化。因此改善洞庭湖區(qū)水質(zhì)和富營養(yǎng)化狀況，加快水體脫氮除磷研究尤為迫切。

利用生物法同步去除氮磷被認(rèn)為是最經(jīng)濟有效的方式，但是在傳統(tǒng)的生物脫氮除磷過程中存在硝化菌和聚磷菌菌齡不同，碳源需求競爭等諸多矛盾。20世紀(jì)80年代，Osborn以及Bortone等相繼發(fā)現(xiàn)某些反硝化菌在硝酸鹽存在情況下具有吸磷功能[2-3]，后來，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些聚磷菌可以利用亞硝酸鹽為最終電子受體進行吸磷，隨后一些兼具脫氮和除磷特性的反硝化聚磷菌被分離出來，使得脫氮除磷同步進行成為可能。已報道的反硝化聚磷菌有不動桿菌屬 (Acinetobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、 氣單胞菌屬(Aeromonas)、 副球菌屬 (Paracoccus)、 寡營養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、莫拉氏菌屬 (Moraxella) 和腸桿菌屬 (Enterobacter) 等[4-6]。

本研究從洞庭湖底泥中分離篩選出1株高效反硝化聚磷菌，并考察了菌株對人工合成模擬湖水的脫氮除磷效果，以期為反硝化聚磷菌處理富營養(yǎng)化水體提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

試驗樣品于2018年7月采自洞庭湖底泥，樣品低溫保存，及時帶回實驗室分離菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04; NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的富集培養(yǎng)。

BTB培養(yǎng)基(g/L)：C4H4Na2O48.5，KNO31.0，KH2PO41.0，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.5，MgSO4·7H2,1.0，CaCl2·7H2O 0.2，BTB(1%溶于酒精)1mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的初篩。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，瓊脂18-20，NaCl 5，pH 7.2，用于菌株的形態(tài)觀察、保存。

缺磷培養(yǎng)基 (g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，Na2HPO4·2H2O 0.023，MgSO4·7H2O 0.081，K2SO40.018，NH4Cl 0.153，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素2mL，pH 7.2。

富磷培養(yǎng)基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NH4Cl 0.305，微量元素2mL，pH 7.2。

富氮富磷培養(yǎng)基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2。

微量元素溶液：Na2EDTA 63.7mg/L，MnCl2·4H2O 5.06mg/L，ZnSO42.2mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0mg/L，CaCl25.5mg/L，CuSO4·5H2O 1.57mg/L，Na2MoO4·4H2O 1.1mg/L，CoCl2·6H2O 1.61mg/L，pH 7.0。

1.1.3 人工合成模擬污水(g/L)

CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2,0.091，CaCl20.02，NaCl 0.02，微量元素溶液 2mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株富集與分離

取10g泥樣接入90mL無菌水中，120r/min振蕩1h，靜置20min，取上清液2mL接種于100mL富集培養(yǎng)基中，28℃，120r/min振蕩培養(yǎng)24h，使微生物快速生長，達到富集的目的。如此重復(fù)接種培養(yǎng)3次后，將富集菌液梯度稀釋，取100μL稀釋液涂布于BTB平板，28℃培養(yǎng)2～3d，挑選周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍色菌落，并用劃線法分離純化獲得單菌落。

1.2.2 菌株的初篩與復(fù)篩

將上述分離出的單菌落，接種于缺磷培養(yǎng)液中，28℃ 培養(yǎng)24h后，在轉(zhuǎn)速為10000rpm 的離心機中離心2min，取其上清液，用滅菌水洗滌，重復(fù)3次，將菌體細(xì)胞重懸于富磷培養(yǎng)基中，在恒溫 28℃的搖床上培養(yǎng) 24h，然后對培養(yǎng)液離心，取其上清液，測定分析接種前后TP濃度的變化，對除磷率高于 50% 的菌株接種于富氮富磷培養(yǎng)基中，28℃，120r/min搖床培養(yǎng)24h后，對TP和TN的含量進行測定，既能夠脫氮又能夠除磷的菌株即為本實驗的目標(biāo)菌株。

1.2.3 菌株鑒定

經(jīng)革蘭氏染色顯微觀察其形態(tài)，再結(jié)合其生理生化和菌落特征進行初步鑒定，然后委托北京諾賽基因組研究中心對16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，應(yīng)用BLAST軟件將所得序列與GenBank中的序列進行同源性分析。

1.2.4 生長曲線測定

菌株的生長情況采用比濁法測定，利用分光光度計以O(shè)D600表示。在30℃，pH7.2，120r/min培養(yǎng)條件下，每2h取樣測定一次。

1.2.5 DT4-2菌株對模擬污水的凈化

將復(fù)篩效果較好的DT4-2菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，28℃，120r/min振蕩培養(yǎng)12h，取3mL菌液離心棄上清，沉淀用無菌水清洗2次，重懸至模擬污水反應(yīng)體系中，用250mL三角瓶作為反應(yīng)器，28℃，120r/min振蕩培養(yǎng)，定時取培養(yǎng)液，10000rpm離心，測定上清液總磷、總氮含量。

1.2.6 外界因素對凈化效果的影響

改變外界環(huán)境因素，如溫度、接種量、作用時間等，按照1.2.5方法測定不同條件下模擬污水中接種前后氮、磷含量變化，計算分析其對TN、TP的去除效率。

1.2.7 測定方法

總氮采用堿性過硫酸鉀分光光度法測定，總磷采用鉬銻抗分光光度法測定，具體操作步驟參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

通過富集培養(yǎng)、初篩復(fù)篩等方法，篩選獲得菌株DT4-2的脫氮除磷效果優(yōu)于其他菌株，因而選擇DT4-2作為后續(xù)實驗菌株。經(jīng)過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，DT4-2為革蘭氏陰性菌，半固體培養(yǎng)基穿刺實驗表明無鞭毛，不能游動。菌落呈圓形，光滑濕潤，近白色，不透明 (圖1)。將菌株DT4-2的16s rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列BLAST比對，結(jié)果顯示DT4-2與Gemmobacter lanyuensis的相似性達99%，因此初步鑒定菌株DT4-2為Gemmobacter lanyuensis。

圖1 菌株DT4-2的菌落

2.2 菌株DT4-2的生長曲線

對篩選得到的DT4-2菌株進行生長曲線測定，得到典型的“S型曲線”(圖2)。從圖2可以看出，菌株DT4-2的延滯期不足2h，說明該菌株能很快適應(yīng)新環(huán)境，3h以后進入對數(shù)生長期，12h后菌株進入穩(wěn)定期，OD600值穩(wěn)定在1.8左右，24h后出現(xiàn)衰退趨勢。說明菌株DT4-2易于培養(yǎng)，穩(wěn)定期持續(xù)時間較長，具有潛在應(yīng)用價值。因此后續(xù)凈水實驗中確定該菌株的活化培養(yǎng)時間為12h，此時菌株的生長速率最大，生物活性最高。

2.3 不同接種量菌體在模擬水中的生長狀況

為確定獲得最佳凈水效果的接種量，將DT4-2按不同接種量接種于人工模擬水中，其生長情況見圖3。除接種量為0的體系中OD600值始終保持為0外，不同接種量下培養(yǎng)體系的OD600值均隨著培養(yǎng)時間的延長而上升。在三個研究時間點中，以2%的接種量菌株的生長最佳，各接種量下菌株的生長表現(xiàn)為OD600-2%>OD600-10%>OD600-4%≈OD600-8%>OD600-6%，因此后續(xù)實驗使用2%的接種量。

圖2 菌株DT4-2的生長曲線

圖3 不同接種量-培養(yǎng)時間下菌株DT4-2的生長情況

圖4 菌株DT4-2在不同作用時間下的脫氮除磷效果 圖5 菌株DT4-2在不同溫度下的脫氮除磷效果

2.4 作用時間對凈水效果的影響

以2%的接種量接種于人工模擬水中，考察獲得最佳脫氮除磷效果的作用時間，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在模擬水反應(yīng)體系中，DT4-2菌株對氮和磷的去除時間相差較大。菌株在模擬水反應(yīng)體系中作用3h后就有快速除磷的效果，作用8h對磷的去除率達到96.7%。而對氮的去除所需時間較長，作用6h后才顯示對氮的快速降解，24h后達到平穩(wěn)上升的階段，作用60h，最大除氮率達到83.3%。

2.5 溫度對凈水效果的影響

溫度對該菌株脫氮除磷效果的影響如圖5所示，當(dāng)溫度為25℃時，菌株對磷的去除達到最大值，去除率為92.9%；當(dāng)溫度30℃時，脫氮效果較好，對氮的去除率為67.8%；當(dāng)溫度超過30℃，脫氮除磷的效果逐漸減弱，因此該菌株對污水脫氮除磷的最適溫度為25～30℃。

3 結(jié)論

(1)通過富集培養(yǎng)、BTB平板涂布篩選、平板劃線純化等方法，從洞庭湖水體和底泥中分離菌株，經(jīng)復(fù)篩得到1株脫氮除磷效果較好的菌株DT4-2。

(2)結(jié)合形態(tài)特征和16s rRNA基因序列分析，確定菌株DT4-2為 芽殖桿菌屬中的Gemmobacterlanyuensis。本研究篩選獲得的芽殖桿菌屬在反硝化聚磷菌的研究報道中較少見。

(3)人工合成富營養(yǎng)化水體的凈化實驗表明，初始接種量為2%時，菌體生長狀況最好，在反應(yīng)體系中作用8h除磷率可達96.7%，作用60h，除氮率可達到83.3%。該菌株適合的脫氮除磷溫度為25～30℃。