誘導(dǎo)性支氣管相關(guān)淋巴組織（iBALT）相關(guān)細(xì)胞因子CXCL13在AECOPD患者肺泡灌洗液中的變化及臨床意義①

蔡星璇 林嬌嬌 李年珍 岳雅麗 杜新 賈俊青

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，汾陽 032200）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種以氣流受限為特征，可預(yù)防、可治療的慢性氣道炎癥性疾病，是全球三大死亡原因之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是指COPD患者癥狀突然加重，甚至引發(fā)呼吸衰竭，是COPD病死率提高的主要原因。細(xì)菌定植則是AECOPD發(fā)病的主要誘因之一［1-2］。IL-6、IL-8和TNF-α屬于促炎因子，在急性炎癥早期顯著升高［3］。越來越多研究證實(shí)，COPD患者體內(nèi)可檢測(cè)到低濃度IL-8、IL-6和TNF-α表達(dá)，且上述促炎因子在AECOPD患者中顯著升高［4-6］。表明炎癥反應(yīng)在COPD發(fā)生及發(fā)展過程中至關(guān)重要。誘導(dǎo)性支氣管相關(guān)淋巴組織（inducible bronchus-associated lymphoid tissue，iBALT），即不同類型抗原刺激后，患者支氣管、肺血管旁以及肺實(shí)質(zhì)中會(huì)產(chǎn)生以B細(xì)胞為主的淋巴濾泡，此外，還會(huì)產(chǎn)生T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞等，共同組成異位淋巴組織，見圖1［7-10］。CXCL13可表達(dá)于B細(xì)胞、T細(xì)胞及濾泡樹突狀細(xì)胞表面，是誘導(dǎo)形成iBALT的重要分子［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，COPD小鼠模型中，中和CXCL13會(huì)破壞支氣管周圍和肺實(shí)質(zhì)中已形成的淋巴濾泡［13］。因此，CXCL13參與iBALT形成以及結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期維持，且可作為反映iBALT發(fā)生及發(fā)展的指標(biāo)之一［8，12-13］。

圖1 香煙煙霧暴露小鼠模型和COPD患者肺組織中iBALT病理學(xué)表現(xiàn)［8，10］Fig.1 Histopathology of iBALT in chronic cigarette smoke exposed to mice and lung tissues of patients with COPD［8，10］

急性細(xì)菌性肺炎患者IL-8、IL-6和TNF-α等促炎因子被激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞激活［9］。M1型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒功能，可介導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞抑制促炎因子，有利于抵抗細(xì)菌感染［14］。COPD穩(wěn)定期患者IL-10等抑炎因子抑制炎癥激活，但會(huì)引起MMP12（matrix metalloproteinase 12，MMP12）上調(diào)［8］。MMP12是M2型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志物，與肺氣腫相關(guān)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，參與極化的M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)iBALT形成［8-9］。綜上所述，急性炎癥期，iBALT啟動(dòng)肺部保護(hù)性免疫反應(yīng)，慢性炎癥期主要加劇肺部疾病惡化［8-9，13，16］。但iBALT對(duì)慢性炎癥性疾病伴有急性感染的作用機(jī)制尚未明確，因此，本文擬分析iBALT相關(guān)細(xì)胞因子CXCL13在AECOPD患者支氣管肺泡灌洗液（bron?choalveolar lavage fluid，BALF）中的變化及臨床意義，初步探討iBALT在AECOPD中的作用，明確iBALT在AECOPD治療中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象選取2019年11月至2020年11月山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治住院因細(xì)菌感染導(dǎo)致COPD急性發(fā)作的患者14例（AECOPD組），并選取同期急性細(xì)菌性肺炎患者24例（單純感染組）。所有研究對(duì)象按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)（2017年版）》采集BALF［17］。納 入 標(biāo) 準(zhǔn)：①AECOPD組 患 者 均 符 合《2021 GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡議：COPD診斷、治療與預(yù)防全球策略》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］；②所有患者均通過影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，包括降鈣素原（procalcitonin，PCT）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEU）或痰培養(yǎng)確認(rèn)肺部存在細(xì)菌學(xué)感染證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①特殊菌群感染（結(jié)核、真菌）所致肺炎；②支原體、衣原體、病毒感染所致肺炎；③伴有心、肝、脾、腎等嚴(yán)重疾病者；④嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良者；⑤自身免疫系統(tǒng)疾病者；⑥惡性腫瘤疾病者；⑦合并嚴(yán)重全身性疾病者；⑧存在精神障礙無法配合檢查者；⑨1周內(nèi)有大咯血和不能耐受支氣管鏡檢查者。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬知情同意。

1.1.2 主要儀器與試劑纖維支氣管鏡（日本富士公司）；2700全自動(dòng)生化分析（日本奧林巴斯）；移液槍（德國(guó)Eppenbof公司）；低速離心機(jī)（B320型，長(zhǎng)沙湘儀離心儀器有限公司）；流式管（美國(guó)Falcon公司）；顯微鏡（日本Nikon）；CXCL13、IL-8、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒（聯(lián)科生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 血清降鈣素原、白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平檢測(cè)采集患者入院后空腹8 h肘靜脈血5 ml，電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)血清PCT、WBC及NEU水平。

1.2.2 BALF采集所有研究對(duì)象按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)（2017年版）》進(jìn)行支氣管肺泡灌洗［17］。采集AECOPD組及單純感染組患者BALF，根據(jù)肺部CT表現(xiàn)及纖維支氣管鏡下表現(xiàn)，選取存在感染表現(xiàn)的肺段作為灌洗部位，灌洗的肺段經(jīng)活檢孔注入1~2 ml 2%利多卡因進(jìn)行局部麻醉。楔入纖維支氣管鏡，經(jīng)活檢孔通過硅膠管快速分次注入37℃滅菌生理鹽水（約100 ml，20~30 ml/次），立即用100 mmHg負(fù)壓吸引回收灌洗液，回收率>40%入組，立即用無菌紗布過濾回收的灌洗液，離心（4℃、1 200 r/min、10 min），收集上清，-80℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.2.3 BALF中細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA試劑盒測(cè)定BALF上清中CXCL13、TNF-α、IL-6和IL-8水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphad Prism 8和Photoshop軟件作圖。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析各項(xiàng)指標(biāo)正態(tài)分布情況，計(jì)量資料采用P50［P25，P75］表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（n）及率（%）表示。組間比較采用Mean-WhitneyU秩合檢驗(yàn)，組內(nèi)兩計(jì)量指標(biāo)相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AECOPD組和單純感染組一般資料比較AECOPD組和單純感染組一般資料比較結(jié)果顯示，兩組患者年齡、性別及吸煙差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），資料具有可比性。AECOPD組WBC、NEU水平高于單純感染組，PCT水平低于單純感染組（P<0.05，表1）。

表1 AECOPD組和單純感染組一般資料比較［例（%）］Tab.1 Baseline characteristics of patients in AECOPD and Lung Infection groups［n（%）］

2.2 兩組患者BALF中CXCL13、IL-8、TNF-α和IL-6水平比較與單純感染組相比，AECOPD組BALF中CXCL13［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］、IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/mlvs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］、TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］均顯著升高，其中IL-8、TNF-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

2.3 兩組患者BALF中CXCL13與IL-8、TNF-α和IL-6相關(guān)性分析AECOPD組和單純感染組BALF中CXCL13與IL-8、TNF-α和IL-6相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AECOPD組CXCL13與IL-8、TNF-α、IL-6呈負(fù)相關(guān)，但與IL-6差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。單純感染組CXCL13與IL-8、TNF-α也呈負(fù)相關(guān)，但與IL-6差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

3 討論

COPD的高發(fā)病率和高病死率給全球造成了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，由于世界人口老齡化等因素，COPD造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)在未來幾十年將持續(xù)增加［1］。AECOPD可加快疾病進(jìn)展，包括肺功能加速下降、生活質(zhì)量嚴(yán)重受損和病死率提高，因此AECOPD防治是控制COPD惡化的關(guān)鍵要素之一［2］。CRISAFULLI等［4］發(fā)現(xiàn)因細(xì)菌感染導(dǎo)致AECOPD的患者（n=241）血液中IL-6、IL-8以及TNF-α水平均高于肺部細(xì)菌感染患者（n=41）。本研究顯示，與單純肺部感染組相比，AECOPD組IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/ml vs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］以及TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］水平升高，與CRISAFULLI等［4］結(jié)果一致。此外，研究已證實(shí)急性炎癥和慢性炎癥中均有iBALT陽性表達(dá)，量化iBALT面積后發(fā)現(xiàn)，CXCL13與iBALT面積呈正相關(guān)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13濃度顯著高于急性細(xì)菌性肺炎患者［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］，提示慢性炎癥急性發(fā)作時(shí)伴有iBALT面積增加。

不同病原體感染的急性肺部感染小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠細(xì)支氣管及血管周圍均有iBALT形成，且iBALT面積與小鼠模型中病原體滴度呈正相關(guān)。隨著病原體滴度下降，仍可觀察到iBALT結(jié)構(gòu)，當(dāng)小鼠體內(nèi)檢測(cè)不到病原體滴度時(shí)，iBALT面積逐漸減少［9-18］。結(jié) 合SHAPOURI-MOGHADDAM等［14］及ZHANG等［19］對(duì)iBALT和巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)性研究結(jié)論可推測(cè)，急性細(xì)菌性肺炎患者中，iBALT可能有利于抵御細(xì)菌感染。CXCL13作為iBALT的標(biāo)志物，可通過CXCL13與促炎因子間的關(guān)系間接反映iBALT對(duì)病原體的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單純肺部感染組CXCL13與促炎因子IL-8（r=-0.789，P<0.001）、TNF-α（r=-0.480，P=0.018）、IL-6（r=-0.280，P=0.171）呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)iBALT在急性炎癥期可抵御細(xì)菌感染。目前慢性炎癥性疾病伴有急性細(xì)菌感染患者中iBALT的作用尚未涉及。本研究證實(shí)，AECOPD組CXCL13與IL-8（r=-0.925，P<0.001）、TNF-α（r=-0.886，P<0.001）、IL-6（r=-0.525，P=0.054）呈負(fù)相關(guān)，與單純肺部感染組結(jié)果一致。因此推測(cè)慢性炎癥性疾病伴有急性細(xì)菌感染患者中，iBALT也可能有利于抵御細(xì)菌感染。

雖然AECOPD組和急性細(xì)菌性肺炎組CXCL13與IL-6均呈負(fù)相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能 與IL-6可 促 進(jìn)iBALT形 成 有 關(guān)［20］。BOTELHO等［21］證實(shí)，小鼠肺組織中IL-6表達(dá)可誘導(dǎo)并激活B細(xì)胞，有利于促進(jìn)iBALT形成。此外，本實(shí)驗(yàn)收集的為患者支氣管肺泡灌洗液，一定程度上限制了本研究樣本量。目前研究認(rèn)為痰誘導(dǎo)與支氣管肺泡灌洗液結(jié)果一致，且痰誘導(dǎo)適應(yīng)證廣泛、禁忌證較少，因此未來可通過痰誘導(dǎo)收集患者痰液標(biāo)本，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以證實(shí)CXCL13與促炎因子的相關(guān)性［22］。

綜上所述，慢性炎癥性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13濃度顯著高于單純急性感染患者。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AECOPD患者與iBALT相關(guān)細(xì)胞因子CXCL13和促炎因子（IL-8、IL-6和TNF-α）呈負(fù)相關(guān)，與急性細(xì)菌性肺炎患者結(jié)果一致，提示iBALT在慢性炎癥性疾病伴有急性感染的患者中也可能有利于抵御細(xì)菌的感染，對(duì)AECOPD患者精準(zhǔn)化治療具有重要意義。