胡黃連苷Ⅱ通過激活自噬作用抑制泡沫細胞的形成與炎癥反應

王明霞 蔡雪峰 林靜 黃宗文

（海南省安寧醫(yī)院神經內科和老年精神科，?？?571100）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一個復雜的病變過程，涉及多種細胞機制和途徑，如炎癥、脂質積聚、氧化應激等，是引起心血管和腦血管疾病、心梗、冠狀動脈疾病和缺血性中風的重要因素。血管內皮下巨噬細胞脂質顆粒的內化均由一系列清道夫受體（scavenger receptors，SRS）調控，每一種受體都能攝取修飾后的低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）。例如，SR-A類受體SR-AⅠ和SR-AⅡ對乙?；兔芏戎鞍缀痛罅垦趸兔芏戎鞍拙哂休^強的親和力，然而SRS并不是巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）的唯一途徑，吞噬和胞吞也可能攝取ox-LDL。

巨噬細胞自噬參與AS過程中泡沫細胞的形成與炎癥反應［3］，巨噬細胞與AS從脂質條紋到斑塊破裂及血栓形成等各個階段密切相關，調節(jié)病變處的脂質膽固醇代謝、炎癥反應以及纖維降解等，對AS性斑塊的形成、增大以及斑塊的穩(wěn)定性有重要作用，抑制巨噬細胞的脂質堆積和泡沫細胞形成，減少巨噬細胞向病變處的遷移和黏附可有效保持斑塊的穩(wěn)定。巨噬細胞也是參與炎癥反應過程中的重要功能分子之一，其中包括NLRP3、ASC和caspase-1三種相關蛋白組成的炎癥小體，促進IL-1β前體成熟并釋放，從而產生炎癥反應。相關研究結果表明，自噬可以調節(jié)巨噬細胞的炎癥反應［4-5］。敲除ATG16L1或ATG7等自噬基因后，經脂多糖（LPS）誘導后，NLRP3介導的炎癥反應增加，表明自噬與抑制NLRP3活化有關［6］。在炎癥過程中，小膠質細胞或巨噬細胞可以激活caspase-1介導的炎癥因子如IL-1β和IL-18的釋放，而促進細胞自噬的藥物可以抑制炎癥因子的釋放和caspase-1的表達。PENG等［7］研究表明ox-LDL可激活NLRP3炎癥小體，從而促進巨噬細胞產生并釋放成熟的IL-1β。

自噬是細胞進化上保守的自我降解過程，可降解損壞或多余的蛋白質、細胞器及大分子物質，降解物被重新吸收利用以達細胞穩(wěn)態(tài)的作用，從而減輕組織細胞損傷［6］。LC3是細胞自噬過程中的標志蛋白，當細胞激發(fā)自噬時LC3Ⅰ通過降解部分多肽，形成LC3Ⅱ以促進自噬體膜的形成，beclin1作為自噬體產生的重要分子可調控自噬體的形成［8］。研究表明自噬的激活可減輕炎癥反應和氧化應激［9-10］。胡黃連苷Ⅱ（化學式為C23H28O13）在許多臟器組織中具有廣泛的藥理作用［11-12］。然而，關于胡黃連苷Ⅱ是否可通過調節(jié)自噬及減輕炎癥反應，從而抑制巨噬細胞泡沫化形成的分子機制目前未見報道。

胡黃連是我國傳統(tǒng)中草藥，可用于治療多種疾病，根據宋代《本草圖經》中記載,胡黃連能夠治療“傷寒勞復身熱，大小便赤如血者”。胡黃連苷Ⅱ是其主要活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，包括神經保護、肝保護、抗膽汁淤積、抗炎和免疫調節(jié)活性［13-14］。研究表明胡黃連苷Ⅱ具有抗氧化與抗炎活性［15-17］。LEE等［18］首次證明了胡黃連苷Ⅱ通過抑制MAPK和NF-κB途徑抑制人單核細胞和人氣管上皮細胞中IL-33的表達與分泌，表明胡黃連苷Ⅱ對于肺部炎癥具有改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞THP-1（人髓系白血病單核細胞）購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物胡黃連苷Ⅱ購自上海源葉生物（HPLC≥98%），用生理鹽水配制成1 mmol/L胡黃連苷Ⅱ母液，過濾除菌低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Thermo Hyclone公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）相關試劑購自美國Apexbio公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自碧云天公司；鼠抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin1、ABCA1、ABCG1、NLRP3、ASC、GAPDH一抗及TNF-α、human IL-10、human IL-6、human IL-1β ELISA Kit均購自英國Abcam；二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG）購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞泡沫化模型建立用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。PMA誘導分化36 h，THP-1細胞形態(tài)由懸浮的圓形細胞轉變?yōu)橘N壁的不規(guī)則形態(tài)細胞，同時伸出偽足，表明THP-1單核細胞已分化為巨噬細胞。

經PMA誘導分化為THP-1細胞源性巨噬細胞后，加入80 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下細胞體積增大，細胞內含物增多，油紅O染色顯紅色圓形脂滴，表明已形成泡沫細胞。

1.2.2 測定細胞活力THP-1細胞以1×104個/孔接種于96孔板，每組設置3個復孔，PMA誘導分化為巨噬細胞后，加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、10、20、30和100 μmol/L），協(xié)同80 μg/ml的ox-LDL孵育48 h，加入培養(yǎng)液組為對照組，加入CCK-8試劑置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使用酶標儀在450 nm下測定各孔吸光度，測定細胞相對活力。細胞相對活力（%）=實驗組A490/對照組A490×100%。

1.2.3 油紅O染色THP-1細胞以2×105個/孔接種于12孔板，每組設置3個復孔，PMA誘導分化為巨噬細胞后，加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、5、10和20 μmol/L）與100 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗滌后37℃油紅O染色30 min，除去油紅O染液，60%異丙醇漂洗殘余油紅O，倒置熒光顯微鏡（×40）下觀察拍照。

1.2.4 檢測細胞內膽固醇含量THP-1細胞以2×106個/孔接種于6孔板，PMA誘導成巨噬細胞后加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、5、10和20 μmol/L）預處理6 h，加入80 μg/ml的ox-LDL培養(yǎng)24 h，收集細胞用PBS清洗3次，依據游離膽固醇（FC）與總膽固醇（TC）含量檢測試劑盒說明，測定各實驗組中游離膽固醇與總膽固醇含量，取適量細胞上清液用BCA法測定蛋白濃度，酶標儀測定OD550值，并校正膽固醇含量。細胞內膽固醇酯（cholesterol ester，CE）=TC-FC。膽固醇酯化率（%）=CE含量/總膽固醇含量×100%。

1.2.5 Western blot THP-1細胞以2×106個/孔接種于6孔板，誘導成巨噬細胞，加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、5、10和20 μmol/L）與80 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)24 h。收集各實驗組細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃下12 000 r/min離心10 min。BCA法測定所得樣品蛋白濃度，均取45 μg蛋白于10%SDS-PAGE分離蛋白，并轉至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入按比例稀釋后的一抗ABCA1、ABCG1、NLRP3、ASC、caspase-1、LC3、beclin1和GAPDH，4℃孵育過夜；TBST洗膜后加入對應二抗，室溫孵育2 h；采用ECL化學發(fā)光試劑在化學發(fā)光儀中顯影曝光，使用Image Lab 5.1.0軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.2.6 ELISA法檢測炎癥因子THP-1細胞以1×104個/孔接種于96孔板，每組設置3個復孔，PMA誘導分化為巨噬細胞后，加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、5、10和20 μmol/L），協(xié)同80 μg/ml的ox-LDL孵育24 h，加入培養(yǎng)液組為對照組。收集各組細胞培養(yǎng)液，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子，從而評估炎癥反應。

1.2.7 免疫熒光實驗THP-1細胞以2×105個/孔接種于12孔板，PMA誘導分化為巨噬細胞后，加入不同濃度的胡黃連苷Ⅱ（0、5、10和20 μmol/L），協(xié)同80 μg/ml的ox-LDL孵育24 h，加入培養(yǎng)液組為對照組。加入4%多聚甲醛固定和0.5%Triton X-100改變細胞膜通透性，5%BCA阻斷1 h，LC3Ⅱ一抗在4℃下孵育過夜，洗滌細胞后室溫下避光孵育二抗1 h，DAPI溶液孵育10 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.8 自噬水平與炎癥小體相關性檢測THP-1細胞以2×106個/孔接種于6孔板，誘導成巨噬細胞，預先加入自噬激活劑200 nmol/L雷帕霉素（rapamycin，RAPA）或自噬抑制劑50 nmol/L巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1，Baf-A1）處理，再加入20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ與80 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)24 h。收集各實驗組細胞，實驗方法同1.2.5 Western blot操作。

1.3 統(tǒng)計學分析使用SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析及繪圖。所有數據以±s表示。組間均數比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度胡黃連苷Ⅱ對THP-1細胞活力的影響如圖1A所示，胡黃連苷Ⅱ在0~100 μmol/L的濃度范圍內不影響THP-1細胞活力，表明胡黃連苷Ⅱ在該濃度范圍內對THP-1無細胞毒性。此外，THP-1細胞與80 μg/ml ox-LDL共培養(yǎng)以誘導泡沫細胞的形成。經ox-LDL誘導后，THP-1細胞的細胞活力顯著降低，與空白組（0 μmol/L）相比胡黃連苷Ⅱ（10~100 μmol/L）處理可顯著提高ox-LDL誘導的THP-1細胞活力（圖1B）。

圖1 胡黃連苷Ⅱ對THP-1細胞活力的影響Fig.1 Effects of picrosideⅡon viability of THP-1 cells

2.2 油紅O染色如圖2所示，Control組細胞內僅有少量細小紅色顆粒，巨噬細胞經ox-LDL刺激后體積增大，胞內有明顯紅色脂滴。5、10、20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ處理后的細胞內紅色脂滴均明顯減少，隨著胡黃連苷Ⅱ濃度增加，呈現出濃度依賴性減少細胞內脂質的沉積，初步表明胡黃連苷Ⅱ可有效改善巨噬細胞對脂質的積累。

圖2 胡黃連苷Ⅱ對巨噬細胞內脂質積累影響（油紅O，×40）Fig.2 Effects of picrosideⅡon cholesterol accumulation in macrophages（Oil red O，×40）

2.3 膽固醇積累與相關蛋白水平檢測如表1所示，經ox-LDL誘導后THP-1源泡沫細胞TC水平顯著增加，胡黃連苷Ⅱ干預后細胞內TC降低。空白對照組巨噬細胞的膽固醇酯化率為（72.20±3.21）%，隨著胡黃連苷Ⅱ濃度的增加（5、10和20 μmol/L），巨噬細胞的膽固醇酯化率逐漸降低［分別為（60.77±7.80）%、（54.33±9.64）%和（47.59±8.73）%］，表明胡黃連苷Ⅱ能夠抑制巨噬細胞膽固醇酯化。采用Western blot驗證胡黃連苷Ⅱ是否作用于巨噬細胞的ATP結合盒轉運體A1（ABCA1）和ABCG1，從而影響巨噬細胞攝取膽固醇。Western blot結果顯示（圖3），5、10和20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ處理后，與ox-LDL+PicrosideⅡ(0 μmol/L)組 相 比ABCA1和ABCG1的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），表明胡黃連苷Ⅱ可能通過促進巨噬細胞膽固醇逆轉運相關膜蛋白ABCA1和ABCG1的表達，加快細胞內膽固醇外排，減少細胞內膽固醇積累。

表1 巨噬細胞內膽固醇含量Tab.1 Cholesterol content in macrophages

圖3 不同濃度胡黃連苷Ⅱ對膽固醇外排蛋白表達的影響Fig.3 Effects of picrosideⅡat different concentrations on expressions of cholesterol-efflux regulatory protein

2.4 胡黃連苷Ⅱ對巨噬細胞炎癥反應的影響如圖4A~C所 示，ELISA實驗 結果表 明，Control組與ox-LDL誘導組中TNF-α［（49.00±3.60）與（131.67±3.06）pg/ml］、IL-1β［（42.67±3.18）與（99.00±4.00）pg/ml］、IL-6［（103.00±7.21）與（303.67±11.72）pg/ml］相比較，ox-LDL誘導組中炎癥因子均顯著提高，與不同濃度的胡黃連苷Ⅱ共同孵育后，巨噬細胞炎癥因子的分泌均減少，其中20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ處理后的巨噬細胞炎癥因子為TNF-α［（42.33±5.86）pg/ml］、IL-1β［（44.33±4.16）pg/ml］、IL-6［（138.67±9.61）pg/ml］，相關炎癥因子的分泌均顯著降低。Western blot實驗顯示胡黃連苷Ⅱ在10 μmol/L和20 μmol/L的 濃 度 下 顯 著 下 調ASC、caspase-1和NLRP3的表達（P<0.05，P<0.01或P<0.001），這些結果表明胡黃連苷Ⅱ能夠有效抑制ox-LDL誘導THP-1細胞產生的炎癥反應（圖4D）。

圖4 胡黃連苷Ⅱ對ox-LDL誘導的THP-1炎癥反應的影響Fig.4 Effects of picrosideⅡon ox-LDL-induced inflammation in THP-1 cells

2.5 胡黃連苷Ⅱ對巨噬細胞自噬活性的影響在ox-LDL誘導的THP-1細胞中評估胡黃連苷Ⅱ的自噬活性。如圖5A所示，在ox-LDL誘導后，LC3Ⅱ/Ⅰ和beclin1的蛋白表達水平顯著增加，表明ox-LDL誘導巨噬細胞激活自噬。5、10、20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ處理巨噬細胞后，與空白組相比LC3Ⅱ/Ⅰ和beclin1的蛋白表達水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01或P<0.001），呈現濃度依賴性提高LC3Ⅱ/Ⅰ和beclin1的蛋白表達且增強自噬。此外，免疫熒光分析表明，ox-LDL可提高LC3Ⅱ的活性，而胡黃連苷Ⅱ處理可進一步增強LC3Ⅱ的活性。

圖5 胡黃連苷Ⅱ對ox-LDL誘導的THP-1自噬的影響（×20）Fig.5 Effects of picrosideⅡon ox-LDL-induced autophagy in THP-1 cells（×20）

2.6 胡黃連苷Ⅱ對巨噬細胞自噬水平與炎癥小體相關性的影響如圖6所示，胡黃連苷Ⅱ或自噬促進劑RAPA處理后均顯著降低ox-LDL誘導的NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達（P<0.05或P<0.01），而自噬抑制劑Baf-A1處理后減弱了胡黃連苷Ⅱ對巨噬細胞炎癥小體相關蛋白表達的作用，表明胡黃連苷Ⅱ促進巨噬細胞自噬并因此下調炎癥小體相關蛋白的表達，巨噬細胞的自噬水平與炎癥小體的激活呈負相關性。

圖6 胡黃連苷Ⅱ通過調節(jié)巨噬細胞自噬影響炎癥小體的表達Fig.6 PicrosideⅡaffects expression of inflammasome by regulating autophagy in macrophages

3 討論

AS是心腦血管疾病的病理基礎，可引發(fā)腦卒中、心肌梗塞和急性冠狀動脈綜合征，是世界范圍內致殘和死亡的主要原因之一。由于缺乏對AS治療有效并無副作用的藥物，目前研究熱點是尋找毒性小，替代療法療效高的新藥物。胡黃連苷Ⅱ是從傳統(tǒng)中草藥胡黃連（clematis chinensis）中提取的主要活性成分之一，具有抗炎活性。LAN等［19］研究表明胡黃連苷Ⅱ通過NF-κB途徑抑制脊髓反應性星形膠質細胞介導的神經炎癥，從而減輕大鼠CCI誘導的神經性疼痛。

然而，關于胡黃連苷Ⅱ在AS形成中的確切作用和機制知之甚少。本研究證明了黃連苷Ⅱ可以通過增強ox-LDL誘導的THP-1細胞自噬，抑制泡沫細胞的形成、膽固醇積累和炎癥反應。此外，還發(fā)現胡黃連苷Ⅱ通過自噬調節(jié)ABCA1/ABCG1表達和NLRP3炎癥體，從而對ox-LDL誘導的巨噬細胞發(fā)揮了保護作用。

泡沫細胞的形成是由于巨噬細胞脂質代謝失衡，導致細胞內膽固醇的過度積累，巨噬細胞內膽固醇平衡主要通過膽固醇逆向轉運，排出過多膽固醇以調節(jié)巨噬細胞內外平衡。膽固醇外流是由膜轉運蛋白ABCA1和ABCG1介導［20］。ABCA1由于具有膽固醇外排和磷脂調節(jié)功能而被稱為膽固醇外排調節(jié)蛋白，ABCG1則可誘導膽固醇與高密度脂蛋白（HDL）結 合 外 排。YUAN等［21］證 實 在ABCA1和ABCG1敲除小鼠中，會加重泡沫細胞及AS的形成。此外，最近的研究確定了幾種源自傳統(tǒng)中草藥的有效成分，如白樺蛋白和亮氨酸，均是通過上調巨噬細胞ABCA1和ABCG1的表達，促進細胞內膽固醇流出并減少細胞內膽固醇積累，有望成為減緩或防治AS的候選藥物［22］。本研究證明胡黃連苷Ⅱ抑制了THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞。此外，胡黃連苷Ⅱ上調ox-LDL誘導的THP-1巨噬細胞ABCA1/ABCG1的表達，從而促進巨噬細胞膽固醇外流。這些發(fā)現表明胡黃連苷Ⅱ通過調節(jié)ABCA1/ABCG1有效促進膽固醇外排，從而減少泡沫細胞的形成。

已有文獻報道氧化應激和ox-LDL等因素可引發(fā)AS的形成，而細胞自噬可有效減緩細胞炎癥并預防AS的形成［23］。本實驗結果也顯示當ox-LDL誘導巨噬細胞時，beclin1表達和LC3Ⅱ/Ⅰ顯著增加。據報道，適度的激活巨噬細胞自噬可調節(jié)膽固醇的外排從而抑制泡沫細胞的形成和炎癥反應，進而預防AS的形成［23-24］。在本研究中，黃連苷Ⅱ處理ox-LDL誘導的THP-1巨噬細胞后，LC3Ⅱ和beclin1的表達以及LC3Ⅱ/Ⅰ進一步增加，表明黃連苷Ⅱ促進自噬激活以阻止AS形成。另外，還發(fā)現巨噬細胞自噬活性與NLRP3炎癥小體之間呈負相關，NLRP3炎癥體被自噬負調控，黃連苷Ⅱ可能部分通過調節(jié)自噬介導的NLRP3炎性體抑制ox-LDL誘導的炎癥反應。

本研究證實了黃連苷Ⅱ通過促進ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞中的自噬來促進ABCA1/ABCG1依賴性膽固醇外排并抑制NLRP3炎癥體，從而抑制泡沫細胞的形成和炎癥反應。為黃連苷Ⅱ在預防和治療AS中提供了基礎理論。