TaNPR1 在小麥抵抗葉銹菌過程中的作用

李 姍，喬金柱，李 燁，賈丁柔，劉 剛，王冬梅

（河北農(nóng)業(yè)大學 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/ 生命科學學院，河北 保定 071001）

小麥作為中國的第3 大糧食作物，一直是國家糧食安全的保障［1］。由葉銹菌（Puccinia triticina）引起的小麥葉銹病，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，流行年份可造成嚴重的產(chǎn)量損失，因此備受人們關注［2］。目前解決這個問題最有效的方法就是尋找抗性基因，培育轉(zhuǎn)基因抗病品種［3-4］。針對不同的葉銹病原菌，小麥在抵抗其侵染的過程中進化出相應的抗病基因來識別并激活其下游的抗病因子［5-6］。然而葉銹菌為了生存也進化出具有更強致病性的菌株，導致原有小麥品種的抗性不斷“喪失”，引起銹病的重新爆發(fā)，這也成為銹病防控中的國際性難題［7］。因此，挖掘持久廣譜抗性基因就顯得尤為重要了。

植物在進化中形成了系統(tǒng)的防御機制抵御病原菌侵染，其中系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance, SAR)為寄主提供了持久的廣譜抗病作用［8］。

NPRs(Nonexpression of pathogenesis-related genes，NPRs)是一類參與植物病害抗性調(diào)控的關鍵因子，可誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性［9］。1994 年，Cao 等在擬南芥突變株中首次發(fā)現(xiàn)NPR1，該突變株缺乏SA、INA 應答，導致了某些病程相關蛋白的表達遭到破壞，并喪失SAR［10］。Dong 等經(jīng)EMS 誘變也得到npr1突變株，并利用圖位克隆技術獲得NPR1序列，分析發(fā)現(xiàn)NPR1 蛋白包含N 末端的BTB/POZ 結構域，Ankyrin 重復結構域和C 末端激活結 構域［11-12］。

NPR1作為SAR 信號轉(zhuǎn)導過程中位于SA 下游并發(fā)揮重要作用的關鍵因子，對植物廣譜抗性的調(diào)控起著關鍵作用［13］。因此，對于植物NPR1基因的功能研究不僅成為植物抗病信號傳導的研究熱點，也成為了植物抗病基因工程領域的重點關注對象。目前，人們對NPR1的研究已經(jīng)積累了一些數(shù)據(jù)，除了模式植物擬南芥，在其他多種植物中也都獲得了NPR1及其同源基因，并對其基因功能進行了分析［14-18］。有證據(jù)表明，在缺乏AtNPR1時，會引起擬南芥中病程相關基因的表達降低，導致擬南芥的抗病性減弱［10］。與之相反，過表達AtNPR1會增強擬南芥抗病基因的表達，抑制丁香假單胞菌的生長［11］。因此，AtNPR1在擬南芥免疫反應中起著不可或缺的作用。同樣將OsNPR1在水稻中過表達，也增強了水稻抗白葉枯病的能力［19］。此外，在草莓中過表達AtNPR1基因，增強了寄主對炭疽病等病害的抗性［20］。將香蕉中的2 個NPR1基因MNPR1A及MNPR1B轉(zhuǎn)入npr1突變體中，發(fā)現(xiàn)可以恢復npr1突變體的抗性［21］。因此，NPR1可增強多種植物對不同病害的抗性，表現(xiàn)出明顯的 廣譜抗性。

小麥往往以過敏性反應（Hypersensitive reaction, HR）的形式抵抗葉銹菌的侵染，HR 屬于植物抗病的ETI 范疇［22］。而NPR1作為SAR 中的關鍵基因，能否在ETI 類型的抗病反應中起作用還不清楚。我們對擬南芥AtNPR1進行結構分析，獲得與其同源的小麥TaNPR1，該基因在小麥抵抗赤霉病的研究中也發(fā)揮著重要作用［23］。本課題組通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)TaNPR1在不同親和性組合中的表達趨勢不同。在此基礎上，本試驗利用qRT-PCR 進一步分析了TaNPR1在小麥與葉銹菌不同親和性組合中的表達變化，并借助病毒介導的基因沉默（VIGS）技術沉默TaNPR1基因的表達以探討TaNPR1在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的HR 中的功能。本研究將拓展人們對TaNPR1在小麥抵御葉銹菌侵染中的功能定位，為培育抗病小麥品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物與葉銹菌

選 用 小 麥（Triticum aestivum） 近 等 基 因 系TcLr26和Thatcher（ 簡 稱Tc）， 本 生 煙 草（N. benthamiana）和葉銹菌（Puccinia triticina）生理小種260。小麥近等基因系與葉銹菌生理小種分別形成不親和組合TcLr26×260 和親和組合Tc×260。葉銹菌的繁殖在感病品種‘鄭州 5389’上進行。

小麥種子萌發(fā)后生長7 d，在第1 片真葉展開時接種葉銹菌生理小種260。然后在黑暗下保濕16 h左右，再將幼苗轉(zhuǎn)移至溫室繼續(xù)培養(yǎng)。小麥和煙草種植及葉銹菌接種參考Gu［24］等的方法。

1.2 TaNPR1 基因的表達分析

小麥幼苗在接種葉銹菌后不同時間點取接種葉片，取樣時間為接種后0、4、8、12、16、24、48、72、96 和120 h。樣品使用液氮速凍，隨后使用冷凍研磨儀將冷凍葉片粉碎。利用Trizol (生工，上海)試劑盒介紹的方法提取總 RNA，依據(jù) TaKaRa 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連 )合成 cDNA。

對TaNPR1進行序列分析，設計qRT-PCR 特異性引物，如表1 所示，以GAPDH作為內(nèi)參基因以排除隨機誤差。

表1 引物列表Table 1 Primer used in the experiment

相對表達量計算方法如下：

ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）ΔΔCt=ΔCt（處理樣本）-ΔCt（對照樣本）相對表達量=2-ΔΔCt

1.3 TaNPR1 的亞細胞定位

設計TaNPR1編碼區(qū)引物，分別在上下游引物兩端添加Hind Ⅲ 和KpnⅠ 酶切位點，見表1。以TcLr26 的cDNA 為模板，擴增TaNPR1編碼區(qū)全長，長度為1 743 bp。隨后與pSuper1300-GFP 載體連接，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。農(nóng)桿菌侵染煙草的濃度OD600=0.6 ～0.8，將侵染后的煙草在黑暗下保濕24 h，取出后再繼續(xù)培養(yǎng)至60 h 左右，利用OLYMPUS BX53F 熒光顯微鏡觀察488 nm 波長下的GFP 綠色熒光分布。

1.4 利用BSMV-VIGS 技術探究TaNPR1 基因的功能

設計TaNPR1特異性片段引物，見表1。構建VIGS 載體并將其命名為BSMV:TaNPR1，酶切線性化BSMV:α、BSMV:β、BSMV:γ、BSMV:TaNPR1和BSMV:PDS。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA，以不同組合混合形成對照組、試驗組和指示組，見表2。以摩擦接種法接種到7 日齡的TcLr26 幼苗第一片真葉上，具體操作步驟參照Gu 等［24］的方法，在黑暗保濕箱中培養(yǎng)12 ～16 h。待沉默PDS的指示組葉片出現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象時，證明病毒成功侵染小麥葉片，此時在第3 片葉上接種葉銹菌生理小種260，在接種后48 和120 h 取接種葉片，一部分剪成1 cm長葉片置于青霉素小瓶中做Rohringer 染色觀察，一部分用于以qRT-PCR 檢測基因的沉默效率。其中Rohringer 染色參照祁艷等［25］方法進行。在目的基因沉默植株的葉片上，統(tǒng)計50 個單侵染點HR 面積及吸器母細胞（Haustorium mother cells，HMC）數(shù)量。

表2 VIGS 組合Table 2 Combinations used in VIGS

2 結果及分析

2.1 小麥與葉銹菌互作過程中TaNPR1 的表達 模式

采用qRT-PCR 檢測TaNPR1在不同親和性組合中的表達趨勢，結果如圖1 所示。在親和組合（Tc×260）中，接種初期（4 h）TaNPR1表達量最高，比0 h 上調(diào)5.7 倍，隨后其表達量逐漸下降。在不親和組合（TcLr26×260）中，其表達量在接種后早期雖有較高水平表達，但其表達量低于親和組合；在接種后期（24 ～120 h）該基因的表達均高于親和組合，且持續(xù)保持在較高的表達水平。這一結果表明TaNPR1參與小麥抵抗葉銹菌侵染過程，可能在不親和組合中對HR 發(fā)揮正調(diào)控作用。

圖1 小麥與葉銹菌互作過程中TaNPR1 的表達分析Fig. 1 Expression analysis of TaNPR1 in the interaction bettwen wheat and Puccinia triticina

2.2 TaNPR1 的亞細胞定位觀察

蛋白質(zhì)的亞細胞定位決定了其發(fā)揮功能的場所，是決定其參與生物學過程的重要因素。為此通過構建TaNPR1 與GFP 融合的植物表達載體，我們進一步分析了TaNPR1 的亞細胞定位，結果如圖2 所示。

圖2 TaNPR1 亞細胞定位的熒光觀察（Bar=20 μm）Fig. 2 Fluorescence observation of the subcellular localization of TaNPR1（Bar=20 μm）

在熒光顯微鏡下我們觀察到TaNPR1-GFP 融合蛋白的熒光在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布。

2.3 TaNPR1 基因沉默影響HR 的發(fā)生及葉銹菌的發(fā)育

HR 是小麥抵抗葉銹菌侵染的重要防衛(wèi)反應，在不親和組合中，寄主通過產(chǎn)生HR 來限制葉銹菌的發(fā)育。本試驗利用VIGS 技術沉默TaNPR1基因，以期對TaNPR1在小麥與葉銹菌互作過程中的功能進行初步探討。首先通過qRT-PCR 檢測目的基因沉默效率（見圖3），接菌后48 h 取樣的植株中，TaNPR1的沉默效率為72%，接菌后120 h 取樣的植株中TaNPR1的沉默效率為60%。將TaNPR1被有效沉默的植株葉片進行Rohringer 染色，通過熒光顯微鏡觀察單侵染點處HR 面積以及葉銹菌HMC的發(fā)育（見圖4）。我們對50 個單侵染點的HR 面積以及HMC 數(shù)量進行統(tǒng)計分析（見圖5），與對照組相比，沉默TaNPR1基因的植株在接菌后48 以及120 h，發(fā)生HR 的細胞面積變大，葉銹菌HMC 數(shù)量增多，說明沉默TaNPR1后使小麥對葉銹菌生理小種260 的抗性減弱。

圖3 TaNPR1 沉默效率檢測Fig. 3 Silence efficiency detection of TaNPR1

圖4 TaNPR1-VIGS 植株葉片的 rohringer 染色及觀察（Bar=100 μm）Fig. 4 Rohringer staining and observation of TaNPR1-VIGS plants (Bar=100 μm)

圖5 50 個單侵染點的HR 面積及HMC 數(shù)量統(tǒng)計Fig. 5 Statistic analysis of HR area and HMC number of 50 single infection

3 討論與結論

NPR1最早在模式植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，迄今已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了6 個NPR基因，根據(jù)其功能將其 命 名 為AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtNPR5、AtNPR6［11,26-27］。隨后人們相繼在水稻［28］、玉米［29］等植物中發(fā)現(xiàn)了NPR1同源基因，并證明NPR1 具有系統(tǒng)廣譜抗病性。本課題組克隆獲得了小麥TaNPR1基因，并對其在小麥抗葉銹病中的功能進行了初步分析。

2018 年，Wang 等分析了小麥和大麥中獲得抗性（Acquired resistance，AR)、系統(tǒng)免疫（Systemic immunity，SI） 和Benzothiadiazole 誘 導 的 抗 性（BTH-induced resistance，BIR)特征，并與模式植物擬南芥和水稻中的SAR 特征進行比較，主要介紹了SAR 下游基因的研究進展，包括抗病相關（PR）基因和BTH 誘導的基因，重點關注了SAR 中關鍵因子NPR1的下游相關基因在抗病中的作用［30］。近期Wang 等報道了NPR1 同源蛋白在小麥抵抗銹菌中的功能及分子基礎，以及在不同逆境條件下NPR1同源蛋白不同結構域所發(fā)揮的作用［31］。小麥往往以HR 的形式抵抗葉銹菌的侵染，HR 屬于植物防御反應的ETI 范疇。而NPR1作為SAR 中的關鍵基因，能否在ETI 抗病反應中起作用，目前證據(jù)還很少。

本課題組通過對小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行分析，發(fā)現(xiàn)TaNPR1在不同親和性組合中表達模式不同。隨后，進一步利用qRT-PCR 檢測了TaNPR1在小麥與葉銹菌不同親和性組合中的表達變化。在親和組合中，TaNPR1在侵染初期表達量較高，隨后逐漸下降；而在不親和組合中，與對照相比，整體呈現(xiàn)較高表達的趨勢，尤其在接種后期（24 ～120 h）該基因的表達均高于親和組合。這一結果暗示TaNPR1參與小麥抵抗葉銹菌侵染的過程，可能對小麥抗葉銹性發(fā)揮正調(diào)控作用。

根據(jù)之前文獻報道，NPR1 的定位受到外界刺激的影響。正常情況下主要以多聚體形式位于細胞質(zhì)中，而當植物受到病原菌侵染后，體內(nèi)SA 水平升高，NPR1 則解聚為單體，入核與TGA 相互作用，調(diào)控下游靶基因的表達［32］。通過對TaNPR1的定位分析，本研究結果也顯示TaNPR1主要存在于細胞質(zhì)和細胞核中，在葉銹菌侵染小麥后是否會影響TaNPR1亞細胞定位的改變?nèi)孕枰M一步探究。本課題組借助VIGS 技術進一步分析了TaNPR1在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的功能，在不親和組合中沉默TaNPR1，發(fā)現(xiàn)沉默植株中的HR 面積與對照組相比變大，HMC 數(shù)量與對照組相比增多，證明植株抗性減弱。這一結果說明TaNPR1影響小麥抗葉銹菌HR 的發(fā)生，正調(diào)控小麥對葉銹菌的抗性。然而，TaNPR1在小麥抗葉銹病中的具體分子機制及信號轉(zhuǎn)導還不清楚，仍需進一步設計試驗進行探究。綜上所述，本研究通過分析TaNPR1的表達模式及其對HR 和葉銹菌HMC 的影響，初步確認TaNPR1正調(diào)控小麥抗葉銹病的能力，為小麥抗病育種提供理論依據(jù)，也為進一步挖掘小麥廣譜抗性基因奠定基礎。