駱駝血清中不同抗體亞型對除草劑 麥草畏的性能研究

何 樅，王志佳，霍靜倩，周 惠，薛 雨，陳 來，張金林

（河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院， 河北 保定 071001）

麥草畏是農(nóng)業(yè)上用于防治雜草的一類常用除草劑，在生產(chǎn)中，麥草畏的不合理使用可能會對土壤和水體造成污染［1］。2019 年1 月我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準了《2018 年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（進口）批準清單》，其中包含孟山都遠東有限公司生產(chǎn)的耐麥草畏大豆（MON 87708）在內(nèi)的20 個耐除草劑作物，這意味著我國開始接受并種植轉(zhuǎn)基因作物，因此麥草畏的使用量也會進一步增加。此外，由于麥草畏漂移作用造成的非靶標作物藥害問題也日益引起廣泛重視。因此，構建麥草畏高效快速檢測方法越顯重要。

近年來，基于納米抗體的酶聯(lián)免疫技術在農(nóng)藥等小分子污染物的快速檢測分析方面發(fā)揮重要作用。納米抗體是20 世紀90 年代，由比利時的Hamers-Casterman C 等人在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)的一種天然缺失輕鏈的IgG2 和IgG3 亞型的重鏈抗體，是目前已知最小的抗原結(jié)合片段［2］。隨后，有研究人員在魚鰩、鯊魚等軟骨魚類動物中也發(fā)現(xiàn)類似重鏈抗體結(jié)構的抗原受體［3］。

納米抗體最初應用于診斷和治療領域，從生物學、免疫遺傳學再到醫(yī)學等各個領域，納米抗體具有常規(guī)抗體無可比擬的優(yōu)點。同時，從結(jié)構上來看，它可以識別常規(guī)抗體不能識別的結(jié)構以及隱蔽表位［4］。此外，相比傳統(tǒng)的抗體而言，納米抗體還具有許多優(yōu)點，例如，它的分子量小，約為15 kD，僅為常規(guī)抗體的1/10；穩(wěn)定性好，水溶性高，不易聚集，可以在細胞中發(fā)揮作用；親和力高，納米抗體與抗原結(jié)合的親和力可達nM，甚至pM 級；它能耐受極端理化環(huán)境，如在90 ℃高溫或蛋白酶存在下仍具有活性，特異性高，易于制備，能夠在原核表達系統(tǒng)中高質(zhì)量生產(chǎn)［5-6］。因而，納米抗體成為檢測食品毒素、農(nóng)獸藥殘留及環(huán)境污染物的理想抗體。

本研究選用河北省唐山市豐南區(qū)漠尚客駱駝養(yǎng)殖專業(yè)合作社的3 歲雄性雙峰駝，并利用麥草畏的免疫抗原對雙峰駝進行免疫，以期獲得具有較好靈敏性和特異性的抗血清，為后期淘選出能夠特異性識別麥草畏的納米抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所使用的麥草畏包被抗原（21-OVA）和免疫抗原（21-Thy）均為河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)藥實驗室制備和保存。試驗過程中所用藥劑均為市售化學純或分析純，所用緩沖液均為河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)藥實驗室制備和保存。

部分緩沖液配方如下：

10×磷酸鹽緩沖液（10×PBS）：320 g NaCl， 8 g KCl，116 g Na2HPO4·H2O，8 g KH2PO4，加超純水定容至4 L，室溫保存。1×磷酸鹽緩沖液（1×PBS）：取100 mL 的10×PBS 和900 mL 超純水，混合均勻，室溫保存。包被緩沖液：取0.795 g Na2CO3和1.465 g NaCO3加超純水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 至9.6，4 ℃保存。1×磷酸鹽吐溫緩沖液（1×PBST）：取2 L 1×PBS和1 mL 吐溫20 混勻后，室溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 血清的采集與處理 將麥草畏的免疫抗原，通過混合弗氏不完全佐劑皮下分點注射于駱駝體內(nèi)。每2 周免疫1 次，免疫6 次后取血。通過靜脈真空采血管收集血液，并于4 ℃保存。取50 mL 無菌離心管，將血液分裝，并于4 000 r/min，4 ℃離心10 min， 取上清分裝保存于-20 ℃。

1.2.2 IgG 分離純化 分離純化具體步驟為：首先用15 mL 的1×PBS 溶液清洗并平衡protein G 柱和protein A 柱，使層析柱內(nèi)的pH 保持中性。之后取3 mL 血清加2 mL 的1×PBS 進行稀釋，并用0.45 μm 濾膜過濾稀釋樣品。將樣品緩慢通過protein A 柱，并收集流出液。該步驟重復2 次，保證蛋白結(jié)合率，之后再次收集流出液。分別用IgG3 buffer，IgG1 buffer 清洗protein G 柱，得到粗蛋白IgG3 和IgG1溶液?；谙嗤恚肐gG2 buffer 清洗protein A柱，得到粗蛋白IgG2 溶液。將收集的粗蛋白溶液用1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 為9.0）調(diào)整pH 至7.0。

將上述所得溶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢驗，并用SDS-PAGE 蛋白快速染液染色30 min，清水脫色并分析IgG 分離純化結(jié)果。

1.2.3 ELISA 評估 取經(jīng)純化得到的IgG1、IgG2 和IgG3 溶液，用1×PBS 在4 ℃條件透析72 h，超濾管濃縮后進行下一步試驗。

取麥草畏包被抗原21-OVA 稀釋500 倍，稀釋后的濃度為0.010 mg/mL，之后將100 μL 稀釋后21-OVA 包被于96 孔板，4 ℃條件下包被過夜；取200 μL 的1×PBST 沖洗3 次并拍干后在孔內(nèi)加入200 μL 的3%脫脂奶粉，并在室溫條件進行封閉反應1 h。經(jīng)3 次200 μL 的1×PBST 沖洗并拍干后，加入稀釋后的血清或IgG 抗體，并在室溫條件進行結(jié)合反應1 h。經(jīng)5 次200 μL 的1×PBST 沖洗并拍干后，向孔內(nèi)加入100 μL 的3 000 倍稀釋后的羊抗駝HIS 二抗，并在室溫條件進行結(jié)合反應1 h。最后用每孔200 μL 的1×PBST 沖洗5 次后并拍干，加入100 μL 顯色液，室溫條件下顯色15 min 后，用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應并用酶標儀進行 讀數(shù)。

采用間接競爭ELISA 試驗評價不同抗體對麥草畏的親和性能和特異性能包被，封閉，洗滌步驟同上。在進行間接競爭反應時，加入抗體的同時加入等量不同濃度的麥草畏或麥草畏結(jié)構類似物溶液。IgG1和IgG3 抑制效果測定所用的麥草畏濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100 μg/mL，IgG2 抑 制效果測定所用的麥草畏濃度為0、0.1、1、5、10、25、50、100 μg/mL，按照此濃度進行稀釋后依次每孔加入50 μL 麥草畏或麥草畏結(jié)構類似物溶液和50 μL 抗體。

在特異性能試驗中，方法、步驟都與親和性能相同，其中IgG 抑制效果測定所用的麥草畏結(jié)構類似物濃度為0、0.1、1、5、10、25、50 和100 μg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origon 8.5 軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，通過標準曲線，得出IC50，以此比較3 種不同抗體亞型對麥草畏的親和性能。

通過測試IgG 對麥草畏結(jié)構類似物的交叉反應率（Cross-reactivity, CR）來評估不同抗體亞型對麥草畏識別的特異性能。CR 由以下公式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 IgG 分離純化

通過交替使用Protein A 和Protein G 親和層析柱，分離純化得到常規(guī)抗體IgG1 和天然缺失輕鏈的重鏈抗體IgG2 和IgG3。如圖1 所示，通過SDSPAGE 驗證，其中IgG1 具有50 kD 的重鏈部分和25 kD 輕鏈部分，而IgG2 和IgG3 只有大小約為 50 kD 的重鏈部分。根據(jù)先前研究報道，3 個亞型大小基本符合［7］。

圖1 不同抗體亞型的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of different antibody subtypes

2.2 免疫前血清ELISA 評估

根據(jù)1.2.3 方法進行試驗，在免疫前對雙峰駝原始血清進行效價評估，其中包被抗原和血清濃度如表1 所示，不同組合間均設置3 個重復。結(jié)果顯示，在包被抗原濃度為0.05 mg/mL 時，不同濃度血清的OD 值沒有差別，分別為0.279 和0.281。隨著包被抗原和血清稀釋濃度的增加，OD 值變化不大。由檢測結(jié)果可知免疫前所用雙峰駝的血清對麥草畏的效價較低，符合試驗要求，可進行下一步的免疫試驗。

表1 原始血清效價分析Table 1 Analyzing the titer of original serum

2.3 免疫后血清ELISA 評估

取濃縮后的IgG1、IgG2 和IgG3，根據(jù)棋盤法篩選抗體與包被抗原最優(yōu)組合。其中包被抗原和抗體濃度如表2 所示，不同組合間均設置3 個重復。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗體稀釋倍數(shù)和包被抗原稀釋倍數(shù)的增加，其OD 值呈下降趨勢。

表2 棋盤法篩選抗體與包被抗原組合Table 2 Checkerboard method for screening the combination of antibody and coating-antigen

2.3.1 血清親和性能測定 根據(jù)表2 結(jié)果篩選出OD值在0.8 ～1.2 之間的組合，分別為21-OVA(0.05 mg/mL) /IgG1(1.08 mg/mL)、21-OVA(0.05 mg/mL) /IgG2(1.25 mg/mL)、21-OVA(0.05 mg/mL) /IgG3(1.25 mg/mL)，進行后續(xù)親和性能的測定。麥草畏濃度如1.2.3 所示。根據(jù)競爭性ELISA 方法，可以得到以麥草畏濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標的S 型標準曲線。如圖2 所示，隨著麥草畏濃度的增大，3 個圖中的OD 值均呈現(xiàn)下降趨勢。圖a 所示，針對麥草畏的IgG1 的IC50值為0.11 μg/mL，線性范圍為0.002 ～5.47 μg/mL；如圖b 所示，IgG2 的IC50值為0.10 μg/mL，線性范圍為0.012 ～2.97 μg/mL；如圖c 所示， IgG3 的IC50值為0.19 μg/mL，線性范圍為0.013 ～2.98 μg/mL。

圖2 不同抗體亞型的IC50 數(shù)據(jù)分析Fig. 2 Analysis of IC50 for different antibody subtypes

從結(jié)果來看，盡管IgG1 的IC50值最低，但3 種亞型IC50值卻相差不大。這說明雙峰駝體內(nèi)產(chǎn)生針對麥草畏的納米抗體的可能性較大，為后期篩選工作奠定基礎。

2.3.2 血清特異性能分析 根據(jù)前人研究報道結(jié)果［8］，對麥草畏結(jié)構類似物進行不同抗體亞型的特異性能分析。在篩選中，發(fā)現(xiàn)IgG1 對2,3,6-三氯苯甲酸有一定的交叉反應。其中IgG1 的IC50值為0.21 μg/mL。而IgG2 和IgG3 并沒有得到相應的IC50值，說明這2種抗體亞型對麥草畏具有較好的特異性。

結(jié)果如表3 所示，在所有麥草畏結(jié)構類似物中，只有IgG1 對2,3,6-三氯苯甲酸存在一定的交叉反應，交叉反應率為52%，而IgG2 和IgG3 無交叉反應。由于IgG1 為傳統(tǒng)抗體，交叉反應現(xiàn)象存在較為普遍。2,3,6-三氯苯甲酸對IgG2 和IgG3 無交叉反應，這表明雙峰駝所產(chǎn)生的重鏈抗體對麥草畏的特異性較高，具有一定研究價值。

表3 IgG 對麥草畏結(jié)構類似物交叉反應Table 3 Cross-reactivity of IgG to structural analogues of dicamba

3 討論與結(jié)論

目前，麥草畏的檢測方法包括氣相色譜［8］、液相色譜［9］等儀器檢測方法。以上檢測法都具備精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)點，但是這些方法不適用于現(xiàn)場檢測，通常需要繁瑣的樣品制備過程，且耗費時間和浪費大量有機溶劑，也不適用于快速檢測大量樣品［10］。在2001 年，Clegg 等人首次開發(fā)出麥草畏多克隆抗體，其IC50為195 ng/mL，靈敏性相對較低［11］。隨后，Huo 等人建立了麥草畏的間接競爭化學發(fā)光酶免疫分析方法（CLEIA），該方法的IC50為0.874 ng/mL，靈敏性比常規(guī)酶免疫法高15 倍以上［12］。然而多克隆抗體也存在一些不足，例如交叉反應率高，不能大量產(chǎn)生，同時對免疫原蛋白純度要求較高并且對外界環(huán)境較敏感等問題，因此不能廣泛應用于各個檢測領域。

近些年，納米抗體由于其高表達量，高穩(wěn)定性以及易于改造等優(yōu)勢逐步成為研究熱點。相對于多克隆抗體和單克隆抗體，納米抗體可變區(qū)中的CDR-H3 抗原結(jié)合區(qū)域更長，穩(wěn)定性更強且具有更豐富的大凸環(huán)抗原結(jié)合構象，可以深入到具有裂縫結(jié)構的抗原內(nèi)部來實現(xiàn)免疫應答［13］。而傳統(tǒng)抗體Fab 片段及單鏈抗體的抗原結(jié)合表面常形成凹形拓撲結(jié)構，通常只能識別位于抗原表面的位點，無法和具有裂縫結(jié)構的抗原結(jié)合［14］，因此納米抗體可以結(jié)合常規(guī)抗體無法接近的抗原表位，從結(jié)構上來講，IgG2 和IgG3 比IgG1 可能具有更強的結(jié)合能力。Xu 等人通過免疫駱駝獲取納米抗體，構建了一種檢測土壤和韭菜中的氰蟲苯甲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的ELISA 方法，其IC50分別為1.2 和1.5 ng/mL［15］。 此外，Li 等人通過免疫美洲駝，分離駱駝血清并提取RNA，進行目的片段擴增，構建納米抗體噬菌體展示文庫以及親和淘選等方法獲得能夠特異性識別2,4-D 的納米抗體，并基于該納米抗體構建了一種快速檢測2,4-D 的熒光酶免疫法（FLEIA），其IC50值為29.2 ng/mL，可以用于監(jiān)測其在環(huán)境水體中的污染［16］。

本研究通過間接競爭性ELISA 試驗，得出3 種不同抗體亞型IgG1、IgG2 和IgG3 的IC50值分別為0.11、0.10 和0.19 μg/mL。3 種 抗 體 亞 型 的IC50值接近且都比較低。同時，在IgG 對麥草畏的特異性試驗中，發(fā)現(xiàn)只有IgG1 對2,3,6-三氯苯甲酸具有一定的交叉反應，說明本研究中獲得的3 種抗體亞型具有較好的靈敏性和特異性，能夠為后續(xù)試驗中篩選出特異性識別麥草畏的納米抗體奠定重要基礎。