睡眠方顆粒劑對對氯苯丙氨酸致失眠大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

馬澤彬，王書玉，閆 欣，許大慶

中國有45.4%的被調(diào)查者在過去1個月中曾經(jīng)歷過不同程度的失眠[1]。改善睡眠習(xí)慣可以使一部分人們改善失眠狀態(tài)，但是也有一部分人們即便改善了睡眠習(xí)慣，也依舊難以入睡。研究顯示睡眠時間過短、失眠或睡眠障礙與高血壓、糖尿病和肥胖具有一定的關(guān)聯(lián)性[2]。目前臨床治療失眠的藥物品種較多，但是長期使用的風(fēng)險有所增加，會造成失眠病人出現(xiàn)戒斷癥狀，如情緒激動、易怒憂郁、心跳加快，胃部不適，甚至產(chǎn)生健忘癥等，同時也逐漸增加了藥物的耐藥性，不斷增加藥量造成反復(fù)循環(huán)的過程，最后服用藥物也不能有效治療失眠癥。本文研究采用睡眠方丸劑治療失眠，將其制備成顆粒劑便于服用,觀察睡眠方顆粒劑的作用機(jī)制，并設(shè)置高、中、低劑量組，尋找合適的劑量，便于臨床使用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物： SPF級雌雄各半健康SD大鼠60只，體重(180±20)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)證號SCXK(寧)2020-0001，分籠進(jìn)行飼料喂養(yǎng)。室溫控制在20～22 ℃，相對濕度控制在45%～65%，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，便于實(shí)驗(yàn)的開展。

1.1.2 試藥：方劑由菟絲子、龍骨、香菇、藜蘆、青鹽、薰衣草、芒硝組成。本方所用藥物如下：菟絲子(批號：1911319)、龍骨(批號：2003259)、香菇、藜蘆(批號：1701155)、青鹽(批號：1807084)、薰衣草(批號：1906150)、芒硝(批號：5660018091)，(藥物換算單位：一兩約等于18 g，一錢約等于3 g)。均購于銀川市第一人民醫(yī)院，且經(jīng)鑒定符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑與儀器：5-HT Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號：U4AQJA2PUG)、5-HIAA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號：BX9T335E23)、NA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號：7VEXVQE6QG)、 DA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號：IHUU7H8FAG)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；PBS緩沖液(產(chǎn)品批號：0033519)購自上海逍鵬生物科技有限公司；對氯苯丙氨酸(PCAP)(產(chǎn)品批號：S02S11Y123233)購自上海源葉生物科技有限公司。連續(xù)波長及核酸蛋白微量檢測酶標(biāo)儀(產(chǎn)品型號：INFITEM200PRO)，購自瑞士Tecan；微型高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 分組：將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照藥睡眠方丸劑組和睡眠方顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只大鼠。除正常組外，其余各組大鼠均建立失眠模型。

1.2.2 模型建立：每天上午9點(diǎn)開始對大鼠腹腔注射對氯苯丙氨酸PCPA混懸液[350 mg/(kg·d)]，每日1次，連續(xù)注射3 d 進(jìn)行觀察，正常組大鼠腹腔注射等體積0.9%生理鹽水。于第1次腹腔注射PCPA混懸液30 h 后，除正常大鼠外，其他組大鼠出現(xiàn)異常興奮，大量活動且不停，提示造模成功。

1.2.3 給藥方法：灌胃治療，每天1次，連續(xù)灌胃7 d。其中正常組、模型組大鼠各0.9%生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)灌胃；陽性對照藥睡眠方丸劑組3 g/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃；睡眠方顆粒劑高劑量組6 g/kg、中劑量組3 g/kg、低劑量組1.5 g/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃。

1.2.4 腦組織取材及處理：灌胃后第7天晚上開始禁食供水12 h，于第8天上午腹腔注射水合氯醛麻醉后全程在冰面上操作，進(jìn)行斷頭處理，迅速取出大腦予以稱重。后續(xù)工作在冰浴環(huán)境下進(jìn)行，避免組織壞死，加同等體積的PBS洗去血液后，手動快速勻漿，待沒有組織塊后，按照Elisa試劑盒要求所有組織液離心10 min，取上清液根據(jù)各指標(biāo)檢測步驟進(jìn)行操作并測定。

1.2.5 檢測指標(biāo)：測定比較各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì) 5-HT、5-HIAA、NA、DA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織5-HT和5-HIAA的含量情況：與正常組比較，模型組大鼠腦組織5-HT含量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照藥睡眠方丸劑組，睡眠方顆粒劑高、中、低劑量組大鼠腦組織5-HT含量顯著升高(P<0.05)；與陽性對照藥睡眠方丸劑組比較，睡眠方顆粒劑高劑量組5-HT含量顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織5-HT和5-HIAA的含量比較

2.2 各組大鼠腦組織DA和NA的含量情況：與正常組比較，模型組大鼠腦組織DA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照藥睡眠方丸劑組、睡眠方顆粒劑高、中劑量組大鼠腦組織DA含量顯著降低(P<0.05)，睡眠方顆粒劑低劑量組含量降低(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠腦組織DA和NA的含量比較

3 討論

《景岳全書》曰：“及別無所累而常多不寐者,總屬真陰精血不足,陰陽不交,而神有不安其室耳”[3]，失眠的病位與腎相關(guān)。失眠的病位與心相關(guān)。睡眠方是治療失眠的經(jīng)典藥方[4]。本研究選擇睡眠方丸劑作為陽性對照藥，一方面肯定了睡眠方丸劑在臨床中的作用；另一方面睡眠方顆粒劑是在原方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過劑型改造后分為高、中、低劑量組進(jìn)行研究，研究要證實(shí)通過劑型改造后睡眠方顆粒劑的作用是肯定的，同時找出最佳劑量便于臨床劑量的確定。進(jìn)一步確定睡眠方顆粒劑對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討其初步的作用機(jī)制。

睡眠與覺醒節(jié)律所涉及的神經(jīng)生理過程較為復(fù)雜[5]，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、5-HIAA、NE/NA、DA等是參與睡眠-覺醒機(jī)制的經(jīng)典單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。李恒飛等[6]學(xué)者用吳茱萸敷貼涌泉穴，觀察對失眠大鼠影響的動物實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，吳茱萸敷貼涌泉穴可通過興奮五羥色胺能神經(jīng)元，抑制藍(lán)斑改善失眠。胡金霞等[7]學(xué)者觀察景衣安神散穴位貼敷對失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，失眠與神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化有關(guān)。其中5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA可以幫助改善睡眠，而DA及NA/NE含量升高能夠引起覺醒，從而導(dǎo)致失眠的發(fā)生。胡文卓等[8]學(xué)者研究蛇床子中香豆素類成分佛手柑內(nèi)酯對失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響認(rèn)為，佛手柑內(nèi)酯的催眠作用與升高腦干內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-HIAA含量，降低腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA含量相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)佛手柑內(nèi)酯可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的含量從而改善睡眠與覺醒周期，進(jìn)而改善睡眠質(zhì)量。本研究顯示，睡眠方顆粒劑對治療失眠大鼠具有一定的作用，但是劑量不同作用程度也不盡相同。與模型組相比，睡眠方顆粒劑高、中、低劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量呈升高趨勢，大鼠腦組織DA、NA呈下降趨勢，說明造模成功。但與陽性對照藥睡眠方丸劑組相比，睡眠方顆粒劑高劑量組大鼠腦組織5-HT含量2.49 μg/g，5-HIAA含量1.60 μg/g，呈升高趨勢；NA含量1.66 μg/g呈降低趨勢；DA含量2.70 μg/g，證明睡眠方顆粒劑高劑量作用優(yōu)于陽性對照藥睡眠方丸劑組。與陽性對照藥相比，睡眠方顆粒劑中劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA、DA、NA含量無統(tǒng)計學(xué)差異。證明睡眠方顆粒劑中劑量作用與陽性對照藥睡眠方丸劑組相似。與陽性對照藥睡眠方丸劑組相比，睡眠方顆粒劑低劑量組大鼠腦組織5-HIAA、DA無統(tǒng)計學(xué)差異，5-HT含量下降、NA含量升高。證明睡眠方顆粒劑低劑量組作用劣于陽性對照藥睡眠方丸劑組。由此可見，睡眠方顆粒劑高劑量組作用效果更好，更適合推薦臨床使用。其作用機(jī)制是通過升高5-HT、5-HIAA，降低DA、NA含量而發(fā)揮作用。

本方的君藥為菟絲子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[9]。菟絲子的功效為滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉。用于陽痿遺精，尿有余瀝，遺尿尿頻，腰膝酸軟，目昏耳鳴，腎虛胎漏，胎動不安，脾腎虛瀉。劉海云等[10]通過對大鼠使用對氯苯丙氨酸進(jìn)行造模，研究菟絲子提取物對失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)菟絲子提取物可以改善大鼠失眠的情況，并通過改善失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，升高血清中5-HT含量，降低DA含量發(fā)揮作用。菟絲煎由菟絲子、人參、山藥等組成，楊志敏教授研究菟絲子認(rèn)為：填精固腎，恢復(fù)腎主封藏的機(jī)能有益于部分慢性失眠患者康復(fù)[11]。菟絲子作為君藥發(fā)揮著補(bǔ)髓填精，補(bǔ)益脾腎從而改善睡眠的作用；龍骨作為重鎮(zhèn)安神藥，鎮(zhèn)靜安神，治驚癇癲狂，怔忡健忘，失眠多夢[12]。《本草綱目》中認(rèn)為龍骨可以“益腎鎮(zhèn)驚”；香菇富含香菇多糖，具有多種藥理活性，藥用價值極高[13]，既具有抗抑郁、抗疲勞的作用，又可以間接保護(hù)長期失眠患者的神經(jīng)系統(tǒng)；薰衣草很早就被用來提取制備成薰衣草精油從而起到治療失眠的作用效果，研究顯示[14]薰衣草精油起到安眠作用的是芳樟醇和其他幾種成分的協(xié)同結(jié)果，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化實(shí)現(xiàn)的。楊瑩等[15]研究證明通過嗅覺途徑吸入薰衣草精油就可以安全而有效地改善原發(fā)性失眠癥患者的失眠情況。本方多種藥物的作用機(jī)制都有不同程度改善睡眠的作用，說明作者選擇使用該方作為研究方向是正確地，但是《名醫(yī)別錄》記載藜蘆其“味苦，微寒，有毒”，張子和《儒門事親》卷十四提到的十八反中指出“諸參辛芍叛藜蘆”，藜蘆的毒性作用大，應(yīng)盡量避免內(nèi)服。且本研究發(fā)現(xiàn)目前的藥方成分中大量使用芒硝和青鹽，口感偏咸的同時還會造成大鼠飲水量增加，間接說明芒硝和青鹽會作用于腎臟，大量的鹽性成分有可能會傷及腎臟。上述這三味藥究竟發(fā)揮著怎樣的作用，其毒性是否對患者用藥產(chǎn)生作用，長期服用本藥物是否發(fā)生毒性蓄積，等等，以上問題有待于進(jìn)一步研究，這為本課題的研究提供了新的思路和方向，筆者會在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，為失眠患者選擇合理藥物提供更多依據(jù)。