游泳訓(xùn)練對(duì)腦出血大鼠認(rèn)知功能及NMDAR表達(dá)的影響

徐澤紅 孫林林 郭付有

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)作為一種常見(jiàn)的腦血管疾病，其病死率和致殘率極高，50%的幸存者有認(rèn)知功能障礙，對(duì)此目前尚缺乏有效的治療方法[1-3]。游泳可改善腦缺血后的認(rèn)知功能障礙[4]，但其對(duì)ICH導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙是否有效，目前尚未明確。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，ICH后神經(jīng)細(xì)胞壞死，突觸可塑性破壞，炎癥因子大量釋放，谷氨酸大量釋放，與 N-甲基-d-天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate receptor, NMDAR)過(guò)度激活有關(guān)。NMDAR包括NR1和NR2B亞基，是記憶形成的基礎(chǔ)，與神經(jīng)突觸的功能和行為認(rèn)知有密切關(guān)系[7]。文獻(xiàn)[8]報(bào)道,可通過(guò)降低NR1和NR2B亞基的表達(dá)改善卒中大鼠的神經(jīng)功能。目前游泳訓(xùn)練改善認(rèn)知功能的機(jī)制尚不明確，本研究建立ICH大鼠模型，觀察游泳訓(xùn)練是否可改善ICH大鼠的認(rèn)知障礙并以NMDAR為靶點(diǎn)進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，由鄭州市第七人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量(300±50)g，8周齡。每籠5只大鼠，飼養(yǎng)溫度22～24℃，光/暗循環(huán)保持12/12 h交替，自由進(jìn)食、水，喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，共3 d(第1天訓(xùn)練10 min，第2天20 min，第3天30 min)。第4天，將大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即假手術(shù)組、模型組、游泳組，每組各10只。本實(shí)驗(yàn)研究方案已得到鄭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器 試劑：蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(Bioswamp，湖北)，一抗NMDAR (CST，美國(guó))，熒光二抗(Santa Cruz，美國(guó))，一抗NR1(Abcam，美國(guó))，NR2B(Abcam，美國(guó))。儀器：正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，Morris水迷宮(淮北正華，安徽)。

1.3 動(dòng)物模型制作方法 模型組和游泳組參考Zhang等[9]文獻(xiàn)所述方法制作動(dòng)物模型，大鼠術(shù)前禁食水6 h后， 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量350 mg/kg。將其以俯臥位固定于腦立體定位儀上。顱頂做切口，暴露冠狀縫，定位右側(cè)尾狀核區(qū) (冠狀縫前0.2 mm，中線(xiàn)偏右側(cè)3 mm)，顱骨鉆孔達(dá)硬腦膜。使用5 μL的微量注射器，沿孔垂直刺入腦內(nèi)，深度達(dá)6 mm，將2 μL I型膠原酶及1 μL肝素鈉溶液以0.3 μL/min的速度緩慢注入尾狀核內(nèi)，總注射時(shí)間為10 min。注射后，停留10 min，然后緩慢將針拔出。拔針后，用醫(yī)用骨蠟密封鉆孔，縫合切口。假手術(shù)組同模型組做切口，顱骨鉆孔達(dá)硬腦膜，插入微量注射器針頭至右側(cè)尾狀核，停留10 min，緩慢拔針，骨蠟封閉，縫合切口。

術(shù)后2 h待大鼠清醒后采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分法(modifiedneurological severity score, mNSS)[10]，評(píng)分7～12分的大鼠視為模型建立成功。

1.4 游泳訓(xùn)練 模型制作成功后1周，游泳組大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練。將大鼠放入游泳池 (直徑：0.6 m，高度：1 m)，水溫保持在29～31℃，水面距桶邊緣0.4 m，每天游泳60 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。另外兩組不進(jìn)行游泳訓(xùn)練。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 造模成功后及經(jīng)1 d、3 d、5 d游泳訓(xùn)練后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。采用mNSS量表[10]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。包括提尾反射、反常運(yùn)動(dòng)、平衡木實(shí)驗(yàn)、行走測(cè)試、反射缺失和感覺(jué)測(cè)試等。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：輕型受損1～6分，中型受損7～12分，重型受損13～18分。

1.6 水迷宮檢測(cè) 造模成功后2周，用水迷宮(morris water maze test, MWM)法評(píng)價(jià)3組大鼠術(shù)后認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠都在MWM里自由游泳15 min。在定位導(dǎo)航任務(wù)中，將大鼠面向池壁隨機(jī)放置在同一象限上，本實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 d，每天記錄大鼠在120 s 內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。取下平臺(tái)，把大鼠放進(jìn)水池，每天記錄120 s 內(nèi)目標(biāo)象限的時(shí)間百分比。

1.7 免疫熒光 完成MWM檢測(cè)后，處死大鼠，取腦組織，常規(guī)石蠟包埋，取厚度5 μm切片，在0.01 M PBS 中清洗切片3次，每次5 min，共15 min，滴加蛋白酶K進(jìn)行消化處理， 37℃條件下孵育5 min。抗原封閉處理采用山羊血清，先滴加一抗 N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDAR, 1∶100，美國(guó)CST)，在4℃條件下孵育過(guò)夜；再滴加二抗(FITC，1∶50，Santa Cruz)，在室溫下孵育90 min。用PBS清洗玻片2次，每次5 min。4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI, 1∶200，Santa Cruz)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，滴加甘油封片。熒光顯微鏡(Olympus, TXM-500C)下觀察，400倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，觀察免疫陽(yáng)性強(qiáng)弱。

1.8 蛋白印跡 完成MWM檢測(cè)后，深度麻醉大鼠，迅速斷頭，冰上取腦，快速分離對(duì)側(cè)海馬CA3區(qū)，置于預(yù)冷EP管中，隨后保存在-80℃的冰箱中，手術(shù)需在2 min內(nèi)完成。將組織切成小塊，加入裂解液，其中混有蛋白酶和磷酸酶抑制劑。放入4℃離心機(jī)1 000 r/min 離心15 min，取其上清液，進(jìn)行蛋白定量，保存在-80℃冰箱。等效樣品(10 μg)高壓鍋煮沸變性，采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，90 V濕式轉(zhuǎn)膜50 min。采用5%脫脂奶粉封閉抗原2 h，一抗NR1、NR2B 在4℃條件孵育過(guò)夜，PBS洗膜5 min，重復(fù)洗3次。1∶1 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，在室溫下孵育1 h。用PBS洗滌3次，每次5 min。按說(shuō)明書(shū)1∶1均勻混合ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光顯影。分析條帶的灰度值利用Image J軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠不同游泳時(shí)間mNSS評(píng)分比較 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，組別和時(shí)間交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即與模型組相比，游泳組的mNSS評(píng)分更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；mNSS評(píng)分隨時(shí)間降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分的比較分)

2.2 3組大鼠不同時(shí)間認(rèn)知功能的比較 3組大鼠逃避潛伏期隨著時(shí)間變化而縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組相比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比較，游泳組在第2、3、4天逃避潛伏期均縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組別和時(shí)間交互作用下無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3組大鼠目標(biāo)象限時(shí)間占比隨著時(shí)間變化而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組相比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)象限時(shí)間占比均減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比較，游泳組在第2、3、4天目標(biāo)象限時(shí)間占比均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組別和時(shí)間交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期和目標(biāo)象限時(shí)間占比的比較

2.3 3組大鼠NMDAR免疫熒光結(jié)果比較 取各組大鼠腦組織，冠狀位切片，進(jìn)行NMDAR免疫熒光染色，置于免疫熒光顯微鏡下觀察CA3區(qū)。假手術(shù)組的樣本可見(jiàn)少量NMDAR免疫陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞被綠色熒光標(biāo)記，陽(yáng)性細(xì)胞占比為(22.5±0.03)%；模型組NMDAR免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)為(60.6±0.05)%，游泳組 NMDAR 免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)為(43.5±0.04)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.309，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

假手術(shù)組 模型組 游泳組

2.4 NR1和NR2B Western blot檢測(cè)結(jié)果比較 采用Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬CA3區(qū)NR1和NR2B蛋白的表達(dá)水平。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA3區(qū)NR1和NR2B表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )；與模型組相比，游泳組海馬CA3區(qū)NR1和NR2B的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)NR1和NR2B Western blot結(jié)果

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)NR1和NR2B蛋白表達(dá)量的比較

3 討論

研究[11]報(bào)道，游泳可改善出血性卒中大鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放，減少突觸損傷，促進(jìn)突觸生長(zhǎng)改善認(rèn)知障礙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比較，游泳組的逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表明游泳可能改善了腦出血大鼠的認(rèn)知功能。

NMDAR是一谷氨酸受體[12]，在靜止?fàn)顟B(tài)下，NMDAR的離子通道被Mg2+阻塞，當(dāng)突觸前膜釋放谷氨酸時(shí)，激活的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，導(dǎo)致突觸后膜的部分去極化，從而NMDAR通道中的Mg2+被清除，NMDAR被激活，大量的Ca2+通過(guò)NMDAR通道流入導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。生理情況下，谷氨酰胺合成酶可以將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[14]。缺血和缺氧情況下，谷氨酸合成酶的表達(dá)量明顯下降，導(dǎo)致谷氨酸釋放引起的興奮性毒性持續(xù)存在[15]。谷氨酸的興奮性毒性可直接導(dǎo)致ICH大鼠的認(rèn)知功能障礙[4]。本研究中，應(yīng)用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)游泳可明顯減少大鼠海馬CA3區(qū)NMDAR的表達(dá)，進(jìn)而減少谷氨酸的神經(jīng)毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，游泳可明顯下調(diào)大鼠海馬中NR1和NR2B的表達(dá)，可能是其改善ICH大鼠認(rèn)知功能(MWM實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng))的分子機(jī)制。NR1和NR2B 是NMDAR的兩個(gè)亞單位，均參與細(xì)胞死亡，該受體激活后導(dǎo)致興奮性毒性和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]。已有研究[17]發(fā)現(xiàn)ICH后繼發(fā)性炎癥與NR1亞單位的表達(dá)和磷酸化有關(guān)。NR1自身抗體可以減少缺血性卒中患者的腦梗死面積[18]。也有研究[19]證實(shí)，使用NR1疫苗或藥物降低NR1的表達(dá)也能保護(hù)腦卒中后的神經(jīng)元，使神經(jīng)元和樹(shù)突結(jié)構(gòu)更加完整，降低興奮性毒性。有研究[20]報(bào)道，使用NR2B抑制劑后，可減輕谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性，保護(hù)腦梗塞后的神經(jīng)元，減少梗塞面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。此外，文旬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NR2B拮抗劑能有效抑制腦梗塞大鼠的神經(jīng)損傷，改善腦梗塞大鼠的空間記憶，提示抑制NR2B的表達(dá)有利于認(rèn)知恢復(fù)。Zhen等[5]在腦出血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，抑制NR2B表達(dá)有利于認(rèn)知功能的恢復(fù)。因此，筆者推測(cè)NR2B受體的激活可能是ICH大鼠認(rèn)知功能受損的重要機(jī)制，游泳可下調(diào)NR2B的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，ICH后大鼠海馬區(qū)NMDAR激活，引起認(rèn)知功能障礙。游泳可能通過(guò)下調(diào)NMDAR的NR1和NR2B亞基的表達(dá)，從而谷氨酸的興奮性毒性被抑制，改善ICH后的認(rèn)知功能。