新型麥胚活性肽對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的抗炎作用

陳元蓉，張 宸，楊高紅，沈新春，宋海昭，熊 玲，王鑾鳳，汪 芳

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

巨噬細(xì)胞是調(diào)控炎癥反應(yīng)的中心細(xì)胞，在炎癥的發(fā)生、維持和解決中起著關(guān)鍵作用[1]。在炎癥發(fā)生過(guò)程中，巨噬細(xì)胞主要通過(guò)抗原呈遞、吞噬和產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的識(shí)別激活了下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[2]，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12等[3]。TNF-α、IL-1β和IL-8通過(guò)協(xié)同誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的產(chǎn)生來(lái)放大炎癥反應(yīng)。IL-6與其受體結(jié)合后，通過(guò)參與抗凋亡基因的表達(dá)，從而防止T細(xì)胞凋亡，最終擴(kuò)大了炎癥反應(yīng)。這些促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)在炎癥反應(yīng)中被上調(diào)。然而，IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，可以抑制促炎細(xì)胞因子的合成，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明食源性多肽具有良好的抗炎活性，其比藥物的副作用低，且呈現(xiàn)出對(duì)靶組織的高特異性，具有低毒高效的特點(diǎn)，其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，從而減輕炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥，在治療慢性炎癥性疾病方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[5, 6, 7]。Hao等[8]從大豆中分離得到的Lunasin肽在LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型中顯示出較高的抗炎活性，并顯著抑制了炎癥細(xì)胞因子的分泌。Gao等[9]研究發(fā)現(xiàn)鱘魚(yú)蛋白衍生的3種肽在LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中，可有效抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的釋放。Ji等[10]研究表明小米谷醇溶蛋白肽(MPP)通過(guò)抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，進(jìn)而顯著減輕炎癥反應(yīng)。Ren等[11]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于榛子蛋白酶水解物的多肽LDAPGHR在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎作用，其通過(guò)抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量來(lái)發(fā)揮抗炎作用。隨著越來(lái)越多的食源性多肽的抗炎活性被發(fā)現(xiàn)，從食品中尋找發(fā)現(xiàn)新型食源性抗炎活性肽將對(duì)炎癥性疾病具有重要意義。

小麥胚芽中麥胚蛋白約占30%，是一種完全蛋白，含有人體必需的8種氨基酸，被稱(chēng)為“人類(lèi)天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”[12]。生物活性肽通常由3～20個(gè)氨基酸組成，在母體蛋白質(zhì)中不起作用。然而，它們可以通過(guò)酶水解、發(fā)酵或食品加工等手段得以釋放。有研究表明，小麥胚芽可提高動(dòng)物對(duì)急性和慢性炎癥的抵抗作用，并通過(guò)抑制血清中促炎細(xì)胞因子的分泌恢復(fù)良好的腸道抗炎環(huán)境，從而治療佐劑性關(guān)節(jié)炎[13]。Jeong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸處理的小麥胚芽提取物(CWG)在LPS刺激的巨噬細(xì)胞模型中顯示出良好的抗炎作用，其通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α的分泌、白細(xì)胞介素IL-6、IL-12和COX-2的合成來(lái)發(fā)揮抗炎作用。雖然已有研究通過(guò)酶解、發(fā)酵等手段得到麥胚活性肽[15]，但通過(guò)體外模擬消化來(lái)得到麥胚抗炎活性肽鮮見(jiàn)報(bào)道，內(nèi)肽酶水解可提高活性肽的生物利用度，避免其在胃腸道中進(jìn)一步被消化。此外，胃腸道酶消化比單一酶消化產(chǎn)生的多肽效果更好[16]。基于此，本研究利用體外模擬胃腸道消化對(duì)麥胚蛋白進(jìn)行酶解，通過(guò)超濾膜分離技術(shù)對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行逐級(jí)分離，根據(jù)各級(jí)分離產(chǎn)物的抗炎活性篩選出具有較高抗炎活性的目標(biāo)肽段，鑒定其氨基酸序列，并結(jié)合PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)結(jié)果篩選出抗炎活性最高的肽序列，進(jìn)一步采用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞體外炎癥模型檢測(cè)其抗炎活性，以期為麥胚活性肽的發(fā)現(xiàn)與分離純化提供研究基礎(chǔ)，并為麥胚蛋白應(yīng)用于抗炎活性肽的開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽；小麥胚芽肽純度>98%。胰蛋白酶(2 500 U/mg)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰凝乳蛋白酶(250 U/mg)；NO試劑盒和ELISA試劑盒(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)；RAW 264.7細(xì)胞株；噻唑藍(lán)(MTT)；胎牛血清(FBS)和RPMI Medium 1640培養(yǎng)基；地塞米松(DEX)；所有分離用有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)，H1850高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific酶標(biāo)儀，2XZ 旋片真空泵，MX-RD-E標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)混均儀，MZE多功能酶標(biāo)儀，ZDDN-II全自動(dòng)凱氏定氮儀器，Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡，Easy-nLC 1200高效液相色譜儀和Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀，SCIENTZ-10N-A冷凍干燥機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 麥胚蛋白的制備

小麥胚芽采用正己烷進(jìn)行脫脂。將脫脂后的小麥胚芽，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩。稱(chēng)取50.0 g小麥胚芽粉加入500 mL蒸餾水，稱(chēng)取5.0 g NaCl用少量水溶解加入溶液中，調(diào)pH至9.0，用磁力攪拌器攪拌提取30 min，再于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，取上清液，然后調(diào)pH至4.0，待沉淀完全后，二次離心10 min，棄去上清液，取沉淀，用蒸餾水溶解并調(diào)pH至7.0，透析脫鹽后，真空冷凍干燥得麥胚蛋白粉，于-20 ℃保存，備用[17]。參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法測(cè)定麥胚蛋白粉中的蛋白含量，小麥胚芽轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.8。

1.3.2 麥胚蛋白體外模擬胃腸消化

根據(jù)Sangsawad等[18]的方法對(duì)模擬胃腸消化過(guò)程略做修改，用去離子水溶解麥胚蛋白凍干粉，攪拌均勻，形成8%的蛋白溶液，95 ℃水浴加熱30 min，調(diào)pH至7.0后使蛋白質(zhì)完全變性。在模擬胃消化階段，用1 mol/L HCl溶液將pH保持在2.0，在37 ℃下用胃蛋白酶(0.4%，干基)消化懸浮液4 h。在模擬腸道消化階段，用1 mol/L NaOH溶液將pH保持在7.6，在37 ℃下用胰蛋白酶(0.3%，干基)和α-胰凝乳蛋白酶(0.1%，干基)消化6 h。消化過(guò)程中每隔1 h采樣，測(cè)定樣品水解度(DH)。消化10 h后，待消化液冷卻至室溫，5 000 r/min離心20 min，收集上清液，透析脫鹽后，于4 ℃下保存待進(jìn)一步分離純化。

1.3.3 水解度測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別取0、100、200、300、400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液于5 mL試管中，加入去離子水補(bǔ)足至400 μL，加入3 mL OPA試劑，混勻，反應(yīng)2 min，測(cè)定吸光度(以去離子水做參比)。以吸光度為縱坐標(biāo)Y，絲氨酸濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

水解度的測(cè)定：取不同時(shí)間點(diǎn)的水解液1 mL，用去離子水稀釋100倍(使測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi))，取稀釋后的水解液400 μL加入3 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，測(cè)定吸光度。在同一條件下重復(fù)測(cè)定3次，根據(jù)測(cè)得的吸光度平均值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出CSerine-NH2(mmol/L)，按公式計(jì)算水解度[19]。

式中：Wserine-NH2為每克蛋白質(zhì)中含serine-NH2的量/mmol/g；x為樣品質(zhì)量/g；P為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；V為樣品水解液體積/L；N為水解液稀釋倍數(shù)；h為水解過(guò)程中每克麥胚蛋白被斷裂的肽鍵數(shù)/mmol/g prot；htot為每克麥胚蛋白質(zhì)所含的總肽鍵數(shù)(8 mmol/g)；α、β分別用常數(shù)1.00、0.40表示。

1.3.4 雙縮脲法測(cè)定多肽含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：用5%的TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL。分別取6.0 mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4.0 mL雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值。以四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[20]。

取2.5 mL樣品溶液，加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，4 000 r/min離心15 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用5%的TCA定容，搖勻。取6.0 mL溶液于15 mL離心管中，加入4.0 mL雙縮脲試劑(樣液：雙縮脲試劑體積比=3∶2)，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度C(mg/mL)，計(jì)算樣品中多肽含量。通過(guò)四肽標(biāo)品的測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.108 9x+0.040 4，R2=0.992 6。

1.3.5 超濾膜分離

選用分子截流量為3 ku和1 ku的超濾膜，采用Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)對(duì)酶解物進(jìn)行分離，分別得到3個(gè)組分WGPH-Ⅰ(>3 ku)、WGPH-Ⅱ(1～3 ku)和WGPH-Ⅲ(<1 ku)。具體操作步驟：用0.1 mol/L，pH 7.6的KH2PO4-K2HPO4緩沖液將樣品配成質(zhì)量濃度為0.1%的溶液，用0.45 μm的纖維素膜過(guò)濾除去不溶物。調(diào)節(jié)泵的壓力控制流速并在4 ℃下進(jìn)行超濾。將超濾后不同分子量的組分脫鹽并冷凍干燥，得到不同分子量的多肽組分，用于下一步的抗炎活性篩選。

1.3.6 Nano-LC-MS/MS測(cè)多肽序列

將肽粉溶于200 μL Nano-HPLC Buffer A中，混勻離心提取上清液，將上清液轉(zhuǎn)入0.22 μm旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器中，收集濾液[21]。

制備C18膜填充柱；將揮干的多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中，然后用40 μL甲醇過(guò)柱離心1遍，棄掉EP管底部液體，重復(fù)2次；40 μL Nano-HPLC Buffer A過(guò)柱離心1遍，棄掉EP管底部液體，重復(fù)2次；多肽樣品過(guò)柱離心1遍，取EP管底部液體再過(guò)柱1遍；40 μL Nano-HPLC Buffer A過(guò)柱離心1遍，棄掉EP管底部液體，重復(fù)2次；更換新的EP管，40 μL 洗脫相Buffer B過(guò)柱離心1遍，收集EP管底部液體，重復(fù)1次。脫鹽后將含多肽樣品的80 μL 洗脫相Buffer B進(jìn)行揮干。

將揮干的多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中。采用Nano-HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1200進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸-水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液。100 μm×20 mm RP-C18色譜柱Trap column以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣并吸附到Trap column柱上，再經(jīng)分析柱，75 μm×150 mm RP-C18色譜柱分離，流速為300 nL/min。樣本間用空白溶劑30 min流動(dòng)相梯度清洗1次。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為，使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)校正液校正，母離子掃描范圍：350～2 000m/z，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴(lài)的采集工作模式下(DDA)，每次全掃描后采集最強(qiáng)的20個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)，碎裂方式為高能碰撞解離(HCD)，NCE能量28，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間25 s。MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000，AGC target設(shè)置為3e6，最大注射時(shí)間100 ms，MS2分辨率設(shè)置為17 500，AGC target設(shè)置為1e5，最大注射時(shí)間50 ms。

1.3.7 多肽合成

利用高效固相肽合成儀合成抗炎肽，并通過(guò)反相高效液相色譜(RP-HPLC)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用對(duì)其純度進(jìn)行了驗(yàn)證，合成的肽在使用前保存在-20 ℃。

1.3.8 抗炎活性的測(cè)定

1.3.8.1 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)RAW 264.7增殖活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7巨噬細(xì)胞，用10% FBS RPIM 1640培養(yǎng)液配制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液100 μL于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，另設(shè)置無(wú)細(xì)胞孔作為空白組。除去96孔板中培養(yǎng)液后，將多肽溶解于含10% FBS的RPIM 1640培養(yǎng)液中制成不同質(zhì)量濃度多肽(20、80、320 μg/mL)培養(yǎng)液，再加到96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后吸去96孔板中溶液，加入50 μL的DMSO溶液，37 ℃恒溫振蕩20 min后在570 nm下測(cè)吸光度[22]。

1.3.8.2 Griess方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中NO含量

同1.3.8.1所述方法培養(yǎng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞，加入不同質(zhì)量濃度多肽(20、80、320 μg/mL)預(yù)保護(hù)2 h，然后加入LPS(1 μg/mL)，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)恒溫(37 ℃)培養(yǎng)24 h。從96孔板各孔中吸取50 μL上清液分別轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔板各孔中，每孔依次加入NO檢測(cè)試劑盒中的Griess Ⅰ和Griess Ⅱ溶液各50 μL，混勻后。在540 nm下的檢測(cè)吸光度值，換算成NO摩爾濃度[23]。

1.3.8.3 炎癥因子的測(cè)定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用ELISA試劑盒(IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α)檢測(cè)炎癥因子含量[24]。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0軟件進(jìn)行student-t檢驗(yàn)，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥胚蛋白體外模擬消化過(guò)程中水解度的變化

測(cè)得小麥胚芽中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(28.47±2.65)%，其純度為(82.49±3.97)%。水解度(DH)表示蛋白質(zhì)的降解程度，目前在評(píng)價(jià)水解效率方面應(yīng)用廣泛。如圖1所示，麥胚蛋白在體外模擬消化階段其水解度整體呈上升趨勢(shì)；在胃消化階段(0～4 h)，麥胚蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，其DH最終達(dá)到6.87%。有研究表明蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)胃蛋白酶的初步水解后其產(chǎn)物一般為分子量較大的多肽[25]。在腸道消化階段(4～10 h)，DH在前2 h加速上升，到達(dá)11.99%并趨于穩(wěn)定，其水解度最終為13.08%。小腸是人體的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收部位，其中胰蛋白酶和α胰凝乳蛋白酶發(fā)揮著重要作用。胰蛋白酶作為內(nèi)肽酶，可以沿底物蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸鏈的中間切割肽鍵。因此胰酶的加入大幅度提高了麥胚蛋白的DH，并產(chǎn)生大量的小分子活性肽。此外，由于消化液濃度的降低以及蛋白質(zhì)底物和酶切位點(diǎn)的減少導(dǎo)致DH逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 麥胚蛋白在不同消化時(shí)間的水解度的變化

2.2 超濾膜分離和多肽含量

超濾分離是分離提純的過(guò)程，其根據(jù)物質(zhì)之間相對(duì)分子質(zhì)量的不同達(dá)到分離的目的。本實(shí)驗(yàn)利用超濾膜對(duì)麥胚消化酶解液進(jìn)行分離純化，以去除分子量大于3 ku的多肽雜質(zhì)，最終得到純度較高的多肽溶液。最終分別得到3個(gè)組分WGPH-Ⅰ(>3 ku)、WGPH-Ⅱ(1～3 ku)和WGPH-Ⅲ(<1 ku)，真空冷凍干燥得到凍干粉后測(cè)得3個(gè)組分的多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(4.03±0.33)%、(4.27±0.24)%和(5.68±0.06)%。不同組分肽段的含量、顏色和澄清度均不相同。大于3 ku超濾膜分離的肽段組分顏色最深，偏黃色，可能含有一些小分子物質(zhì)存在。其他組分顏色為黃白色或白色，低分子量多肽的澄清度高于高分子量的澄清度。

2.3 麥胚抗炎活性肽的篩選

2.3.1 麥胚多肽(WGPHs)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)探究麥胚多肽WGPH-Ⅰ(>3 ku)、WGPH-Ⅱ(1～3 ku)和WGPH-Ⅲ(<1 ku)在不同濃度下對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，不同組分對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的活力產(chǎn)生了一定的影響。當(dāng)質(zhì)量濃度在20～320 μg/mL時(shí)，3個(gè)組分對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力均無(wú)顯著影響(P>0.05)，表明其在20～320 μg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒性。而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到640 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，表明過(guò)高濃度的麥胚多肽對(duì)細(xì)胞毒性較大。因此，綜合細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇20、80、320 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究其抗炎作用。

注：**表示與LPS模型組相比具有極顯著差異(P<0.01)。

2.3.2 麥胚多肽(WGPHs)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

NO是一種重要的跨膜分子信號(hào)，能夠損傷機(jī)體周?chē)M織，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)分泌大量NO。已有報(bào)道表明LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞可以急劇增加NO的釋放量，造成細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[26]。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型分析不同多肽組分的抗炎活性。通過(guò)Griess法檢測(cè)麥胚多肽(WGPHs)對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響。結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO分泌量明顯升高(P<0.01)，其釋放量增加了5.98倍，表明該模型成功。麥胚多肽WGPH-Ⅰ和WGPH-Ⅱ干預(yù)組NO濃度與模型組相比無(wú)顯著差異；WGPH-Ⅲ干預(yù)組則顯著抑制了NO的釋放，表現(xiàn)出較好的抗炎活性。WGPH-Ⅲ組分的分子量(<1 ku)低于WGPH-Ⅰ和WGPH-Ⅱ組分，表明分子量較小的多肽其抗炎活性可能更高。該結(jié)果與Torresfuentes等[27]的研究相似。因此，選擇WGPH-Ⅲ組分進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜鑒定以及抗炎活性的進(jìn)一步驗(yàn)證。

注：##表示與正常組相比有極顯著差異(P<0.01)，*表示與LPS模型組相比具有顯著差異(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比具有極顯著差異(P<0.01)，下同。

2.4 Nano-LC-MS/MS鑒定WGPH-Ⅲ(<1 ku)多肽序列

采用Nano-LC-MS/MS對(duì)WGPH-Ⅲ的多肽組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其色譜主要出峰時(shí)間集中在7～90 min，對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～67%，表明WGPH-Ⅲ多肽呈現(xiàn)非極性，推測(cè)多肽中可能含有一定量疏水性氨基酸。

通過(guò)Mascot 2.3軟件分析得到與小麥胚芽蛋白質(zhì)組中同源性最高的20個(gè)短肽。從350～2 000m/z中，選取峰面積前14的碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，共鑒定出14條多肽，其氨基酸序列及分子量如表1所示，這些肽均由7～12個(gè)氨基酸組成，且觀察肽序列可以看出Phe(F)、His(H)、Trp(W)、Cys(C)和Tyr(Y)等小分子疏水氨基酸殘基高頻率出現(xiàn)，說(shuō)明其生物活性好。通過(guò)Peptide Ranker數(shù)據(jù)庫(kù)(http://distilldeep.ucd.ie/Peptide Ranker/)對(duì)每個(gè)肽進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)肽的生物活性概率。從預(yù)測(cè)結(jié)果可以得出，疏水氨基酸多且分子量小的肽活性較強(qiáng)。其中APEPEPAF(P1)、MDTSAPSPF(P2)、IDIPNGR(P3)和VDPAVPPK(P4)序列活性較強(qiáng)，因此，通過(guò)高效固相肽合成儀合成4條多肽，進(jìn)一步驗(yàn)證其生物活性，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 肽段的二級(jí)擬合質(zhì)譜圖

表1 目標(biāo)肽段的鑒定及生物活性的預(yù)測(cè)

2.5 小肽P1、P2、P3和P4分別對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響

通過(guò)Griess法檢測(cè)小肽P1、P2、P3和P4對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響，結(jié)果如圖5所示，與空白組相比，模型組的RAW 264.7細(xì)胞NO分泌量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，小肽組的NO濃度均明顯降低，且隨著濃度的增加，NO的分泌量逐漸降低，表明P1、P2、P3和P4都可以抑制RAW 264.7細(xì)胞NO的分泌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性，且具有劑量依賴(lài)性。其分子機(jī)制可能是LPS激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)局部炎癥和抗體的產(chǎn)生，并影響體內(nèi)iNOS的表達(dá)，從而影響NO的產(chǎn)生。其中小肽P1的抗炎活性最好，在炎癥性疾病的治療或預(yù)防中具有潛在意義。因此，選取P1(APEPEPAF)進(jìn)行下一步研究。

圖5 小肽P1、P2、P3、P4對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO分泌量

2.6 小肽P1(APEPEPAF)對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的影響

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，LPS的生成量會(huì)隨革蘭氏陰性菌數(shù)量增加而增加，影響炎癥性疾病的發(fā)生，且長(zhǎng)期的炎癥會(huì)成為腫瘤發(fā)展的主要誘因[28]。經(jīng)LPS刺激后，巨噬細(xì)胞會(huì)合成或釋放炎癥因子，阻斷炎癥因子是抑制炎癥的一個(gè)有效治療策略。采用Elisa試劑盒測(cè)定LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)(IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β)的分泌量，并分析小肽P1對(duì)炎癥因子水平的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 小肽APEPEPAF對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7分泌炎癥因子的影響

與正常組相比，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后，其促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌顯著升高(P<0.05)。當(dāng)小肽P1或陽(yáng)性藥DEX干預(yù)后，與LPS組相比，促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌顯著得到抑制(P<0.01)。此外，與正常組相比，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，其抗炎因子IL-10的分泌顯著升高(P<0.01)，小肽P1或陽(yáng)性藥DEX干預(yù)后均在不同程度上增加了抗炎因子IL-10的分泌，隨著小肽P1干預(yù)濃度的增加，其分泌量呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)(P<0.01)。

通過(guò)檢測(cè)炎癥因子分泌水平的結(jié)果表明，小肽P1對(duì)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌具有抑制作用，對(duì)抗炎因子IL-10的分泌有一定的促進(jìn)作用。即小肽P1能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌，呈現(xiàn)出良好的改善炎癥的作用效果，表明小肽干預(yù)后能在蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。

已有研究表明，多肽的抗炎活性與其氨基酸組成存在密切關(guān)系，Saisavoey等[29]和Zhao等[30]研究發(fā)現(xiàn)含有P、F殘基的多肽具有抗炎活性；此外，Liang等[31]發(fā)現(xiàn)玉米多肽—PPYLSP和FLPPVTSMG也呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性。由此推測(cè)，含有P、F、L等氨基酸殘基的多肽呈現(xiàn)出較好的抗炎活性；本研究中小肽P1(APEPEPAF)、P2(MDTSAPSPF)、P3(IDIPNGR)和P4(VDPAVPPK)的氨基酸序列中含有P、F等氨基酸殘基，其中小肽P1的P、F氨基酸殘基最多，且抗炎活性最強(qiáng)，小肽P1由于含有P、F等氨基酸殘基而呈現(xiàn)出較好的抗炎活性，說(shuō)明小肽P1在預(yù)防或治療炎性疾病方面具有很大的應(yīng)用潛力，可以作為一種新型的抗炎藥物用于疾病的預(yù)防和治療。

3 結(jié)論

采用堿溶酸沉法、體外模擬胃腸道消化法、超濾膜分離以及PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)，從麥胚蛋白消化產(chǎn)物中分離篩選得到14條新的生物活性肽，并進(jìn)一步通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7炎癥模型，篩選得到抗炎活性較強(qiáng)的4條抗炎活性肽，P1(APEPEPAF)、P2(MDTSAPSPF)、P3(IDIPNGR)和P4(VDPAVPPK)，均能降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO的分泌量。其中抗炎活性最強(qiáng)的小肽P1，其氨基酸序列為APEPEPAF，分子量為856 u，該小肽能夠顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO及促炎因子的分泌，說(shuō)明麥胚蛋白可作為抗炎肽的前體，通過(guò)內(nèi)肽酶的酶解得以釋放，且安全性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，可以作為一種潛在的功能性食品加以開(kāi)發(fā)利用。