菜籽餅粕中多肽的提取純化及抗腫瘤活性

熊 川， 羅 強(qiáng)， 黃文麗， 李 萍， 張 娟， 金 鑫， 朱 宇

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所1，成都 610061) (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肝炎研究所2，重慶 623000) (四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所3，成都 610066)

油菜籽，十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)作物油菜(BrassicanapusL.)的種子，是世界范圍內(nèi)最主要的植物油原料之一。我國(guó)是油菜種植大國(guó)，國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2019年我國(guó)油菜種植面積為6 583.09 hm2，油菜籽產(chǎn)量為1 348.47萬(wàn)t，占世界總年產(chǎn)量的四分之一[1]。我國(guó)油菜籽主要用以食用油的生產(chǎn)，浸提或壓榨后會(huì)產(chǎn)生大量的菜籽餅粕。目前，受制于提取加工技術(shù)研究的匱乏，菜籽餅粕主要用于燃料與肥料，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值尚存極大的開(kāi)發(fā)空間。菜籽餅粕營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等[2]。此外，菜籽餅粕氨基酸組成接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦值，氨基酸分布平衡，含有豐富的含硫氨基酸及一定量的賴(lài)氨酸，是一種優(yōu)良的天然植物蛋白資源[3]。因此，深入研究菜籽餅粕的蛋白質(zhì)提取利用，對(duì)提高油菜籽產(chǎn)業(yè)價(jià)值鏈具有重大意義。

植物蛋白提取中關(guān)鍵的一步是破碎細(xì)胞壁以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，一般包括單一球磨、高壓均化處理，酶法以及物理法等[4]，這些操作方法復(fù)合使用，能夠有效去除部分纖維及還原糖，提高蛋白提取率和純度[5]。以菜籽餅粕為原材料，獲得的菜籽餅粕蛋白需要進(jìn)一步酶解以獲得菜籽餅粕多肽，酶解法具有反應(yīng)條件溫和、效率高、不產(chǎn)生消旋作用等優(yōu)點(diǎn)，但是蛋白酶具有底物專(zhuān)一性，因此篩選合適的蛋白酶是酶法制備多肽的重要步驟[6]。菜籽餅粕多肽多是相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000 u的小肽，傳統(tǒng)分離方法的區(qū)分精度受限，因此，需結(jié)合凝膠過(guò)濾色譜和反向高效液相色譜進(jìn)行純化。

多肽(polypeptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物，且通常情況下?tīng)I(yíng)養(yǎng)和生理功能優(yōu)于蛋白質(zhì)(大分子蛋白質(zhì))和氨基酸。目前，獲得的多肽藥物主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽等，多肽藥物與一般的有機(jī)小分子藥物相比，具有生物活性強(qiáng)、用藥劑量小、毒副作用低和療效顯著等突出特點(diǎn)[7]。菜籽餅粕是提取天然植物多肽的理想來(lái)源，目前，來(lái)源于菜籽的蛋白已有相關(guān)報(bào)道，菜籽球蛋白(Cruciferin)為11/12S球蛋白，富含賴(lài)氨酸和甲硫氨酸，平均分子量為300～360 ku，具有良好的凝膠特性[8]。菜籽白蛋白(Napin)為1.7/2S白蛋白，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸，具有良好的溶解性、成膜性、較高的熱穩(wěn)定性及耐胃蛋白酶特性[9]。但鮮有針對(duì)菜籽餅粕多肽及其生理活性的報(bào)道。

本研究以菜籽油生產(chǎn)的副產(chǎn)物菜籽餅粕為原料，綜合物理法和酶法進(jìn)行提取，聯(lián)用凝膠過(guò)濾色譜和反向高效液相色譜進(jìn)行多肽的純化，建立一套適宜于菜籽餅粕分離純化的方法。進(jìn)一步構(gòu)建細(xì)胞模型，探索菜籽餅粕多肽的抗腫瘤活性，最終鑒定出具有抗腫瘤活性的多肽，為多肽類(lèi)藥物和菜籽油產(chǎn)業(yè)的深度開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽餅粕自然干燥，過(guò)100目篩后獲得干粉，備用；人宮頸癌Hela細(xì)胞系、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素，3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)(MTT、Caspase檢測(cè)試劑盒)、細(xì)胞色素C檢測(cè)試劑盒；其余試劑均為分析純。

Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機(jī)，Microfuge 20R高速離心機(jī)，F(xiàn)orma 3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Quest 10中高壓層析系統(tǒng)，1260 Infinity II半制備型高效液相色譜，N-1210BS-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SpectraMax L酶標(biāo)儀，CKX53倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菜籽餅粕多肽提取與純化

1.2.1.1 菜籽餅粕總蛋白提取

稱(chēng)取菜籽餅粕干粉50 g，置于燒杯中，按照菜籽餅粕干粉/PBS緩沖液(pH 6.8)的料液比1∶20加樣，放入超聲-微波協(xié)同萃取儀中，微波功率80 W，處理時(shí)間8 min，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心20 min，吸取上清液，計(jì)算蛋白的提取率。

式中：V為菜籽餅粕蛋白提取液的總體積/mL；W1為提取液中蛋白的含量/g/100 mL；m為菜籽餅粕的質(zhì)量/g；W2為菜籽餅粕中蛋白的含量/g/mL，W1和W2采用凱式定氮法測(cè)定。

1.2.1.2 菜籽餅粕多肽的分離

通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用堿性蛋白酶Protex6L作為菜籽餅粕總蛋白的水解酶。水解條件設(shè)定為：底物添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，加酶量5 500 U/mL，通過(guò)添加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保證反應(yīng)中pH維持在10，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為2 h，溫度設(shè)定為55 ℃，反應(yīng)后6 000 r/min條件下離心5 min收集上清液，冷凍干燥獲得菜籽餅粕總多肽干粉。

取菜籽餅粕總多肽干粉5 g，無(wú)菌水溶解，配制成50 mg/mL的溶液，上樣于Superdex 30 Increase 凝膠過(guò)濾柱，無(wú)菌水洗脫，通過(guò)Bio-rad的Quest 10中高壓層析系統(tǒng)收集洗脫液，215 nm下測(cè)定吸光值，收集并凍干單一峰，得到菜籽餅粕總多肽復(fù)合物。

1.2.1.3 菜籽餅粕多肽的純化與鑒定

取菜籽餅粕總多肽復(fù)合物1 g，無(wú)菌水溶解，配制成10 mg/mL的溶液，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化，收集單一峰，冷凍干燥獲得菜籽餅粕多肽。反相高效液相色譜條件設(shè)定為：采用C18色譜柱，流動(dòng)相A相為純凈水，流動(dòng)相B相為含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；單針進(jìn)樣量為30 μL，測(cè)定流速設(shè)定為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；檢測(cè)洗脫條件設(shè)定為：A相為0～6 min，99%～97%；6～10 min，97%～96%；10～16 min，96%～80%；16～22 min，80%～99%。

通過(guò)解析菜籽餅粕多肽的氨基酸序列。液相A液為含0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈溶液。色譜柱以A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，再經(jīng)色譜柱梯度分離，流速為0.3 mL/min，柱溫70 ℃。質(zhì)譜條件：樣品用TripleTOF 5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)18 min，檢測(cè)方式：正離子，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：600～3 500 m/z。

1.2.2 菜籽餅粕多肽形態(tài)觀(guān)察

取質(zhì)量為1 mg的菜籽餅粕多肽置于附有銅膠帶的樣品臺(tái)，通過(guò)離子濺射儀在樣品表面鍍上一層導(dǎo)電金粉，置于掃描電鏡下觀(guān)察。樣品在20.0 kV加速電壓下進(jìn)行檢查[10]，選擇清晰的視野拍照。

取質(zhì)量為1 mg的菜籽餅粕多肽溶解于蒸餾水中，配制成0.25 mg/mL的溶液，25 ℃進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，在190～260 nm范圍內(nèi)，以1 nm間隔和1 nm帶寬采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 菜籽餅粕多肽對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，96孔板置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為7組，每組8個(gè)復(fù)孔，分別為對(duì)照組(100 μL含血清DMEM培養(yǎng)基)和6個(gè)菜籽餅粕多肽組(含有菜籽餅粕多肽的培養(yǎng)基)，菜籽餅粕多肽的最終質(zhì)量濃度依次為12.5、25、50、100、200、400μg/mL，空白孔不接種細(xì)胞，加入100 μL含血清DMEM培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.4 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色

按照3×105個(gè)/孔的密度接種Hela細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽處理12 h。丟棄培養(yǎng)基，每個(gè)孔中的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，在冰上用滲透溶液(0.1%Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉)處理細(xì)胞2 min。最后將細(xì)胞重新懸浮在含有10 μL TUNEL反應(yīng)化合物的200 μL PBS溶液中，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h，用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察染色情況[11]。

（1）大跨度巷道不同的開(kāi)挖順序?qū)ο锏绹鷰r破壞區(qū)域、應(yīng)力分布和位移量均有明顯的影響，先開(kāi)挖小斷面有利于巷道頂?shù)装宓姆€(wěn)定，而先開(kāi)挖大斷面有利于巷道兩幫的穩(wěn)定。

1.2.5 Hela細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位測(cè)定

通過(guò)5,5,6,6-四氯-1,1,3,3-四乙基咪唑啉碘化物(JC-1)測(cè)定線(xiàn)粒體膜電位的變化。將Hela細(xì)胞以密度為3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁后，將不同質(zhì)量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽添加到細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。PBS溶液重懸細(xì)胞。加入JC-1于Hela細(xì)胞中，最終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，反應(yīng)15 min。使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀記錄熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出Hela細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位的變化。

1.2.6 細(xì)胞色素C釋放測(cè)定

通過(guò)蛋白免疫印跡法測(cè)定Hela細(xì)胞中細(xì)胞色素C的釋放情況。Hela細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，細(xì)胞貼壁后用不同質(zhì)量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽處理12 h。預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，使用細(xì)胞色素C釋放凋亡檢測(cè)試劑盒提取細(xì)胞線(xiàn)粒體和胞漿蛋白質(zhì)。收集的蛋白質(zhì)部分裝載在12%SDS-PAGE凝膠上，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡法進(jìn)行分析[12]。一抗選擇細(xì)胞色素C抗體(細(xì)胞色素C兔單克隆抗體4280)，二抗選擇GAPDH。

1.2.7 Caspase表達(dá)活性

Hela細(xì)胞按照密度為3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁后，將不同質(zhì)量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽添加到細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。通過(guò)PBS溶液清洗，采用Caspase-9和-3活性檢測(cè)試劑盒完成Caspase活性檢測(cè)。重懸并收集細(xì)胞，加入裂解液并于冰上裂解5 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，反應(yīng)緩沖液處理，405 nm下測(cè)定吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽餅粕的分離純化

通過(guò)磷酸鹽緩沖液(PBS)提取，結(jié)合超聲-微波萃取，獲得菜籽餅粕總蛋白的得率為(68.82±2.23)%。堿性蛋白酶Protex6L水解菜籽餅粕總蛋白，獲得菜籽餅粕總多肽的得率為(34.41±1.96)%。

2.1.2 菜籽餅粕多肽(RMP)純化及鑒定

將提取獲得的菜籽餅粕總多肽上樣于Superdex 30 Increase凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行純化，圖1a顯示，菜籽餅粕總多肽依據(jù)分子量的大小能夠獲得3個(gè)洗脫峰，經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶Protex6L水解后，菜籽餅粕多肽分子量較小，出峰較晚。通過(guò)抗腫瘤活性的初篩，選擇A2組分進(jìn)一步分離純化。如圖1b所示，A2上樣于RP-HPLC后，能夠分離出4個(gè)組分，通過(guò)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用初篩，B3組分具有最好的抑制活性，因此收集B3組分作為菜籽餅粕多肽(RMP)。最終通過(guò)LC-MS-MS測(cè)定，確定RMP的氨基酸組成為Asp-Val-Phe-Val-Pro-Pro-Val-Leu(圖1c)，相對(duì)分子質(zhì)量為886 u。

圖1 RMP的分離純化

2.2 RMP的形態(tài)觀(guān)察與測(cè)定

在掃描電鏡下，RMP呈現(xiàn)不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)，片狀結(jié)構(gòu)的邊緣出現(xiàn)不規(guī)則的卷曲(圖2a)。圓二色譜的結(jié)果顯示，如圖2b，RMP在198 nm附近有一吸收帶，在220 nm附近有一較弱吸收帶，上述特征吸收表明RMP具有不規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，在水溶液中，48.9%的LRP呈無(wú)規(guī)卷曲，31.7%的LRP呈β-折疊。

圖2 RMP的形態(tài)觀(guān)察與二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 RMP對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響

RMP處理Hela細(xì)胞24 h，通過(guò)MTT法測(cè)試細(xì)胞的存活率。結(jié)果如圖3所示，較低濃度的質(zhì)量濃度介于12.5～25 μg/mL的RMP對(duì)于Hela細(xì)胞的活性未見(jiàn)明顯影響。隨著RMP濃度的升高，逐漸表現(xiàn)出對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用，50 μg/mL的RMP對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為18%，200 μg/mL的RMP則超過(guò)50%，RMP濃度進(jìn)一步提高，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率則未見(jiàn)顯著提升。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中RMP的作用質(zhì)量濃度設(shè)定為50、100、200 μg/mL。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05, **P<0.01)。圖3 RMP的細(xì)胞毒性

2.4 RMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡

為了確定RMP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用是否是由于細(xì)胞凋亡引起的，通過(guò)TUNEL法觀(guān)察Hela細(xì)胞DNA斷裂情況(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于4′, 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的存在，所有細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)被激發(fā)出藍(lán)色熒光，而由于4甲基羅丹明-5-dUTP的存在會(huì)使得凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核激發(fā)出紅色熒光。因此，在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)淡綠色熒光。圖4中，未處理的Hela細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。不同濃度的RMP處理后，某些細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核呈淡綠色，而其他細(xì)胞依舊保持藍(lán)色，且隨著RMP作用計(jì)量的增加，細(xì)胞核呈現(xiàn)淡綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴(lài)性增加。

圖4 RMP引起Hela細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)變化觀(guān)察 (比例尺=50 μm)

2.5 RMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)理探索

2.5.1 RMP對(duì)Hela細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC-1在基質(zhì)中匯聚形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光，而線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中，以單體形式存在而產(chǎn)生綠色熒光。圖5表明，正常細(xì)胞中，JC-1聚合物與單體的比率為(1.58±0.07)，RMP處理后，Hela細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位顯著下降，且與RMP的濃度呈現(xiàn)計(jì)量依賴(lài)關(guān)系，200μg/mL的RMP處理12 h，聚合物與單體的比率降低為(0.18±0.02)。

注：不同小寫(xiě)字母代表5%水平的差異。圖5 線(xiàn)粒體膜電位分析

2.5.2 RMP對(duì)Hela細(xì)胞中細(xì)胞色素C釋放的影響

如圖6所示，正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞中未能在胞漿中檢測(cè)到細(xì)胞色素C的存在，RMP作用后，Hela細(xì)胞胞漿中的細(xì)胞色素C含量顯著升高，且隨著RMP作用劑量的增大，逐步升高。100 μg/mL的RMP處理12 h，線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(55.53±3.24)%，胞漿中則為(45.39±4.09)%。200 μg/mL的RMP處理12 h，線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(43.13±3.89)%，胞漿中則為(96.98±5.51)%，與100 μg/mL處理組呈現(xiàn)顯著性差異，結(jié)果表明細(xì)胞色素C從Hela細(xì)胞線(xiàn)粒體中釋放而進(jìn)入胞漿。

圖6 RMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞中細(xì)胞色素C的釋放

2.5.3 RMP對(duì)Caspase表達(dá)活性的影響

如圖7所示，RMP的處理使得Hela細(xì)胞中Caspase表達(dá)活性顯著升高，低質(zhì)量濃度的RMP(50 μg/mL)處理12 h，Caspase-9的表達(dá)活性達(dá)到對(duì)照組的(172.26±4.68)%，Caspase-3則為(185.35±6.36)%。RMP作用濃度升高，Caspase表達(dá)活性也顯著升高，200 μg/mL的RMP對(duì)應(yīng)的Caspase-9為(247.62±5.66)%，Caspase-3則為(255.39±6.02)%。

圖7 RMP對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-9和-3活性的影響

3 討論

3.1 菜籽餅粕多肽的制備

目前，以菜籽餅粕或菜籽蛋白為原料獲得菜籽餅粕多肽的方法主要有酶法、化學(xué)法以及微生物發(fā)酵法，應(yīng)用較廣泛的為酶解法制備菜籽餅粕多肽。酶解法反應(yīng)條件溫和，有利于保持氨基酸的原有構(gòu)型，但是蛋白酶具有底物專(zhuān)一性，因此，選擇合適的蛋白酶是酶法制備菜籽餅粕多肽的重要步驟。本研究中，選擇堿性蛋白酶Protex6L水解菜籽餅粕總蛋白制備多肽，最終得率接近35%。有報(bào)道，堿性蛋白酶Alcalase水解獲得多肽的得率為40%[13]，造成這種差異的原因可能在于菜籽餅粕自身蛋白質(zhì)含量及酶解反應(yīng)條件等。從菜籽餅粕總多肽中純化出單一多肽的方法多在探索階段，目前鮮有標(biāo)準(zhǔn)化流程化方法的報(bào)道。本研究中，依據(jù)分子量大小的分子排阻色譜和依據(jù)極性的反向高效液相色譜進(jìn)行聯(lián)用，純化出RMP，這在天然植物多肽的純化上應(yīng)用較廣[14]，但在菜籽餅粕多肽上的應(yīng)用則較少。此外，菜籽餅粕蛋白水解后的總多肽種類(lèi)很多，其相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)存在差異，如何能高效分離純化菜籽餅粕多肽是今后研究的重點(diǎn)。

3.2 RMP對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

已有研究表明，在細(xì)胞凋亡的后期，DNA被降解成大小多為180～200 bp的片段，并且許多3′-OH末端被暴露出來(lái)，可以通過(guò)與某些特定的染料(如FITC)結(jié)合來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡[15, 16]。因此，本研究中首先通過(guò)TUNEL染色來(lái)確定Hela細(xì)胞的狀態(tài)，RMP的處理能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，說(shuō)明RMP抗腫瘤的活性是借助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

3.3 RMP誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制探索

研究表明，在不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，線(xiàn)粒體膜電位會(huì)隨著細(xì)胞形態(tài)的改變而降低，甚至在細(xì)胞形態(tài)改變之前也會(huì)降低[17, 18]。線(xiàn)粒體膜電位的降低常常伴隨著細(xì)胞色素C的釋放，而細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到胞漿，是線(xiàn)粒體啟動(dòng)凋亡程序的關(guān)鍵步驟之一[19]。許多研究已經(jīng)報(bào)道，某些天然產(chǎn)物可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。黑木耳(Auriculariaauricular)多糖可以促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡[20]。目前，就菜籽餅粕多肽的抗腫瘤活性更多的集中于增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面的研究，具體的作用通路尚不明了[21]。

研究證實(shí)，Caspases在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用。細(xì)胞凋亡可以認(rèn)為是一種Caspases對(duì)底物進(jìn)行不可逆的有限水解的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程。早期的研究表明，線(xiàn)粒體釋放的細(xì)胞色素C與Caspase-9的前體結(jié)合，觸發(fā)其活性[22]。激活的Caspase-9(啟動(dòng)子Caspase)能觸發(fā)Caspase-3(效應(yīng)子Caspase)，Caspase-3通過(guò)水解Caspase靶蛋白引起細(xì)胞凋亡[23]。本研究中，RMP能夠促進(jìn)Caspase-9和-3的活性，實(shí)現(xiàn)Hela細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

通過(guò)分子排阻色譜和反向高效液相色譜法從菜籽餅粕中分離純化出小分子多肽(RMP)并驗(yàn)證了RMP的抗腫瘤活性。RMP相對(duì)分子質(zhì)量為886 u，由8個(gè)氨基酸組成，序列為Asp-Val-Phe-Val-Pro-Pro-Val-Leu，RMP結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于人工合成。分子排阻色譜和反向高效液相色譜法連用能夠?yàn)椴俗扬炂啥嚯牡姆蛛x純化提供一種參考方法?？鼓[瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，RMP能通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，即降低Hela細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體到胞漿的釋放，進(jìn)而激活Caspase蛋白，執(zhí)行細(xì)胞凋亡。因此，RMP有望作為一種抗腫瘤活性物質(zhì)在腫瘤預(yù)防和治療的保健品和藥品中發(fā)揮作用。