基于斑馬魚模型評(píng)價(jià)發(fā)酵對(duì)麥麩多糖抗氧化活性的影響

陳秋燕，王瑞芳，王 園，安曉萍，楊艷平，宋 敏，齊景偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心2,呼和浩特 010018)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物之一，麥麩是小麥加工的副產(chǎn)物，資源十分豐富。研究發(fā)現(xiàn)麥麩富含豐富的多糖、礦物質(zhì)、膳食纖維、酚類物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[1，2]。多糖是麥麩中最典型的功能性物質(zhì)。麥麩多糖主要由非淀粉多糖組成，其含量高達(dá)46%左右，是小麥細(xì)胞壁的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，麥麩多糖具有抗氧化、降低膽固醇、提高機(jī)體免疫力、抗癌、降血脂、降血壓等多種功效[3-7]，而我國(guó)目前大部分麩皮僅被用于傳統(tǒng)釀酒、飼料等領(lǐng)域，仍缺乏對(duì)小麥麩皮資源的深度開發(fā)利用，對(duì)其功能性食品的開發(fā)仍處于較低水平，因此，如何更高效地利用麥麩資源，對(duì)提高其附加值具有重要的意義。對(duì)于麥麩中活性多糖的提取目前常采用熱水浸提法、超聲波輔助提取法和酶解法等[8-10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，通過益生菌發(fā)酵麥麩可提高其多糖、酚酸和糖醛酸等生物活性物質(zhì)的含量[11]，發(fā)酵可以使微生物產(chǎn)酶過程與酶作用過程合二為一，是一種控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放的可行方法，比物理或者化學(xué)法具有高特異性、高效率、副作用少等特點(diǎn)，因此，已得到廣泛應(yīng)用[12-14]。

利用體外實(shí)驗(yàn)(包括細(xì)胞、生化、微生物等)評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性，雖具有高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，但其結(jié)果難與人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比[15]。利用小鼠等哺乳動(dòng)物模型研究天然物質(zhì)的抗氧化活性已較為普遍，但這一方法存在成本高、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜等問題，不便于進(jìn)行在體內(nèi)的功能研究。斑馬魚(Daniorerio)是國(guó)際認(rèn)可的新型模式生物，具有體積小、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、生理結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物高度相似等特點(diǎn)，已被美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所列為繼人類和小鼠后的第三大模式生物。另外，利用斑馬魚模型開展相關(guān)研究具有材料易獲得、易操作、周期短、高效、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)，且具有對(duì)哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)性強(qiáng)、可比度高等優(yōu)點(diǎn)，因此，可以有效彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)和哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的巨大生物學(xué)斷層，已被廣泛用于天然產(chǎn)物生物活性評(píng)價(jià)[16,17]，特別是其體內(nèi)抗氧化活性的評(píng)價(jià)[18,19]。

利用枯草芽孢桿菌與釀酒酵母發(fā)酵麥麩后其粗多糖具有較強(qiáng)的自由基清除能力[20]；發(fā)酵麥麩阿魏酰低聚糖可通過提高大鼠血漿和組織中抗氧酶活性降低 DNA氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物8-OHdG的含量，從而有效緩解由敵草快誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[21]；證明了發(fā)酵麥麩多糖在體外及體內(nèi)鼠模型中均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。然而，關(guān)于未發(fā)酵麥麩多糖與發(fā)酵麥麩多糖抗氧化活性的對(duì)比研究鮮有報(bào)道。因此，本研究擬以分離純化后的未發(fā)酵與發(fā)酵麥麩多糖作為原料，以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)比研究發(fā)酵對(duì) 麥麩多糖抗氧化活性的影響，研究結(jié)果將為麥麩資源的深度開發(fā)利用和抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：市售；斑馬魚成魚來源國(guó)家斑馬魚資源中心(中國(guó)，武漢)；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCF-DA)、1,3-雙(二苯膦)丙烷(DPPP)、吖啶橙(AO)、二甲基亞砜(DMSO)、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋，LRH-250F生化培養(yǎng)箱，IX51奧林巴斯倒置顯微鏡，微孔板分光光度計(jì)，倒置熒光顯微鏡TS2R。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥麩多糖的制備

麥麩的發(fā)酵參照史俊祥[20]的方法，以B.subtilis(CGMCC 1.892)和S.cerevisiae(CGMCC 2.119)為菌種，含量為1×108CFU/mL，接種比例為3.3∶6.7，將菌種按照體積分?jǐn)?shù)10.4% 接種量與麥麩混合，料水比為1∶1.16，于36 ℃條件下發(fā)酵47 h得到發(fā)酵麥麩；將同樣的菌比、接種量、料水比添加到麥麩中得到未發(fā)酵麥麩。將未發(fā)酵與發(fā)酵后的麥麩濕樣分別置于45 ℃烘箱中烘干48 h，粉碎過篩，準(zhǔn)確稱取未發(fā)酵與發(fā)酵麥麩粉各100 g置于1 000 mL蒸餾水中，80 ℃熱水浸提30 min，3 500 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行濃縮，采用sevage法對(duì)濃縮液進(jìn)行去蛋白，用80%乙醇進(jìn)行沉淀，4 ℃條件下沉淀12 h，離心，取沉淀進(jìn)行減壓濃縮，再進(jìn)行冷凍干燥獲得未發(fā)酵與發(fā)酵麥麩粗多糖。進(jìn)一步利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱對(duì)麥麩粗多糖進(jìn)行分離純化，以蒸餾水為洗脫劑，流速為0.5 mL/min進(jìn)行洗脫，收集組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，最終獲得未發(fā)酵麥麩多糖(WBP)與發(fā)酵麥麩多糖(FWBP)。

1.3.2 斑馬魚的飼養(yǎng)及胚胎收集

野生型斑馬魚親魚購(gòu)于國(guó)家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，在(28.5±1)℃、14/10 h光/暗周期條件下飼養(yǎng)，每日交替飼喂人工配合飼料和初孵豐年蟲4次，飼喂1 h后清除殘餌和糞便，每天換水1/3，養(yǎng)殖期間持續(xù)充氧，定期監(jiān)測(cè)水質(zhì)參數(shù)。

胚胎收集方法：實(shí)驗(yàn)前一天晚上按照雌∶雄為1∶2的比例挑選健康斑馬魚親魚15尾置于孵化箱中，并用隔板將雌、雄魚分開，保持魚房黑暗環(huán)境，于第2天早上將隔板移除，利用自然光照刺激親魚產(chǎn)卵，30 min后將胚胎收集于培養(yǎng)皿中，用胚胎培養(yǎng)液清洗數(shù)次，放置于干凈的燒杯中培養(yǎng)備用。

1.3.3 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

在體視顯微鏡下挑選受精后7～9 hpf且發(fā)育正常的斑馬魚胚胎放置于含有2 mL不同質(zhì)量濃度(0、25、50、100、200、300 μg/mL)WBP和FWBP培養(yǎng)液的24孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置4重復(fù)(孔)，每個(gè)重復(fù)10枚胚胎。將24孔板放在控溫水浴鍋(28.5 ℃)中孵化，每隔12 h更換1次培養(yǎng)液，受精后24、48、72、96 h分別在體視顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育狀況，統(tǒng)計(jì)胚胎死亡率，在96 hpf統(tǒng)計(jì)胚胎孵化率。從48 hpf開始在顯微鏡下記錄仔魚心率，并采集其側(cè)面照測(cè)量不同處理組初孵仔魚體長(zhǎng)、計(jì)算卵黃囊體積。每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)挑選4尾仔魚，計(jì)數(shù)其在60 s內(nèi)的心跳次數(shù)。體長(zhǎng)為從仔魚吻短到尾柄基部的距離，卵黃囊體積大小計(jì)算依據(jù)公式：

V=a×b2/6

式中：a和b分別為卵黃囊主軸和副軸的長(zhǎng)度。

胚胎死亡率為96 h內(nèi)死亡胚胎總數(shù)占放入胚胎總數(shù)的百分比；96 hpf胚胎的孵化率為該時(shí)間點(diǎn)孵化出膜仔魚數(shù)占總胚胎數(shù)的百分比。

1.3.4 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化能力的影響

1.3.4.1 WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎ROS產(chǎn)生率、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過氧化率的影響

根據(jù)WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響的結(jié)果，選擇50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。挑選7～9 hpf的胚胎轉(zhuǎn)移至含有2 mL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培養(yǎng)液的24孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10枚胚胎，置于28.5 ℃控溫水族缸中繼續(xù)孵育，在胚胎發(fā)育至24 hpf更換為正常胚胎培養(yǎng)液。待胚胎發(fā)育至72 hpf時(shí)從每個(gè)重復(fù)組中隨機(jī)挑選5尾仔魚進(jìn)行熒光染色，其中ROS產(chǎn)生率、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過氧化率分別使用DCF-DA(20 μg/mL)、吖啶橙(7 μg/mL)和DPPP(25 μg/mL)染色。將斑馬魚仔魚分別避光染色處理1 h、30 min、1 h后，用正常胚胎培養(yǎng)液清洗數(shù)次，用MS-222麻醉，置于熒光顯微鏡下捕獲熒光照片，利用image J軟件測(cè)量其熒光強(qiáng)度，以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各處理組的相對(duì)熒光強(qiáng)度[22]。ROS相對(duì)產(chǎn)生量/細(xì)胞相對(duì)死亡率/脂質(zhì)過氧化率=處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。

1.3.4.2 麥麩多糖對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化酶活性的影響

挑選7～9 hpf的胚胎轉(zhuǎn)移至含有2 mL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培養(yǎng)液的24孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度7個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40枚胚胎，置于(28.5±1)℃的水族缸中繼續(xù)孵育，在胚胎發(fā)育至24 hpf時(shí)取樣，用胚胎培養(yǎng)液清洗胚胎，置于2 mL離心管中，加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)制成10%組織勻漿液，4 ℃，3 500 r/min離心，取上清液用于抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。CAT、SOD、GSH-PX活性和MDA含量測(cè)試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，所有操作均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，利用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA模型進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 WBP和FWBP的毒性評(píng)價(jià)

2.1.1 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

由圖1可知，當(dāng)WBP和FWBP暴露96 hpf，WBP和FWBP質(zhì)量濃度達(dá)到或高于50 μg/mL時(shí)，斑馬魚胚胎死亡率隨暴露質(zhì)量濃度的升高逐漸增加，表明WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎的毒性具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性，且WBP組斑馬魚胚胎死亡率顯著高于FWBP組(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)WBP組胚胎死亡率接近30%，而FWBP組胚胎死亡率低于20%，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，2組斑馬魚胚胎死亡率均超過50%。

注：不同小寫字母表示不同質(zhì)量濃度WBP與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示不同質(zhì)量濃度FWBP與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，含有相同標(biāo)簽表示差異不顯著(P>0.05)，*表示W(wǎng)BP與FWBP差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，25～100 μg/mL的WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率無(wú)顯著影響，而當(dāng)WBP和FWBP質(zhì)量濃度達(dá)到及高于200 μg/mL時(shí)顯著降低斑馬魚胚胎的孵化率，且WBP組孵化率顯著低于FWBP組(P<0.05)。

圖2 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.1.3 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍的FWBP和25～200 μg/mL WBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎心率無(wú)顯著影響。而與對(duì)照組跟100 μg/mL WBP相比，當(dāng)WBP暴露質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)可引起斑馬魚心率顯著降低(P<0.05)。

圖3 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

2.1.4 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚初孵仔魚體長(zhǎng)和卵黃囊體積的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)WBP和FWBP質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，斑馬魚初孵仔魚的體長(zhǎng)顯著減小(P<0.05)，而50 μg/mL的FWBP組斑馬魚初孵仔魚的體長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)，其他質(zhì)量濃度組斑馬魚初孵仔魚體長(zhǎng)無(wú)顯著變化。

圖4 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎體長(zhǎng)的影響

由圖5可知，WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚卵黃囊體積無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖5 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚卵黃囊體積的影響

當(dāng)WBP和FWBP暴露質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL導(dǎo)致胚胎死亡率增加、孵化率降低、體長(zhǎng)變短，心跳減慢，顯著影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育表現(xiàn)出明顯的毒性作用，綜合考慮，選擇50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP進(jìn)行抗氧化能力比較研究。

2.2 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化能力的影響

2.1.1 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)ROS產(chǎn)生量的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的WBP和FWBP暴露顯著降低了斑馬魚體內(nèi)的ROS產(chǎn)生量(P<0.05)，且在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)FWBP組的ROS產(chǎn)生量顯著低于WBP組(P<0.05)。表明WBP和FWBP暴露可減少斑馬魚ROS產(chǎn)生量，且FWBP的作用強(qiáng)于WBP。

圖6 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

2.1.2 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的影響

由圖7中可知，質(zhì)量濃度為50～200 μg/mL 的WBP和FWBP暴露均顯著降低斑馬魚體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化率(P<0.05)，且質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL 時(shí)FWBP對(duì)斑馬魚的脂質(zhì)過氧化率的降低作用顯著強(qiáng)于WBP組(P<0.05)。表明WBP和FWBP均能通過抑制斑馬魚仔魚脂質(zhì)過氧化，且FWBP的作用優(yōu)于WBP。

圖7 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)過氧化率的影響

2.1.3 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞死亡的影響

由圖8可知，WBP和FWBP暴露均可顯著降低斑馬魚仔魚的細(xì)胞死亡率(P<0.05)，雖然WBP和FWBP之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但FWBP處理組斑馬魚的細(xì)胞死亡率略低于同質(zhì)量濃度的WBP處理組。

圖8 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞死亡的影響

2.1.4 WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎抗氧化酶活性的影響

由圖9～圖11可知，與對(duì)照組相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP暴露顯著提高了斑馬魚胚胎中總超氧化物歧化酶活性，且在200 μg/mL質(zhì)量濃度下FWBP組總超氧化物歧化酶活性顯著高于WBP組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的WBP和FWBP暴露均顯著提高了斑馬魚胚胎中過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05)，且到質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)FWBP組過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于WBP組(P<0.05)。

圖9 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎總超氧化物歧化酶活性的影響

圖10 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎過氧化氫酶活性的影響

圖11 不同質(zhì)量濃度WBP和FWBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

3 討論

3.1 WBP和FWBP安全性評(píng)價(jià)

Wang等[22]評(píng)估川芎多糖對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)已經(jīng)顯著抑制了胚胎的生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為其體長(zhǎng)降低了，在質(zhì)量濃度為500、800 mg/L時(shí)，斑馬魚胚胎的致死率高達(dá)100%。本研究結(jié)果表明，當(dāng)WBP和FWBP質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)均會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎心率顯著降低、死亡率提高、孵化率降低及初孵仔魚體長(zhǎng)降低，表明高質(zhì)量濃度的WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育產(chǎn)生一定的毒性作用。而低于300 μg/mL質(zhì)量濃度的WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響相對(duì)較小。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇50、100、200 μg/mL的WBP與FWBP進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)。

3.2 WBP和FWBP的抗氧化活性評(píng)價(jià)

氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)作用失衡引起的結(jié)果，通常與不同的病理作用有著直接的相關(guān)性[24]?；钚匝?ROS)是包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等的化學(xué)活性分子，是自然形成的代謝副產(chǎn)物。ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)損害生物分子功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷[25]。人體抗氧化系統(tǒng)可分為酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)，酶類抗氧化系統(tǒng)主要由SOD、CAT、GSH-Px等體內(nèi)自身的抗氧化酶系組成，其作為體內(nèi)抗氧化的第一道防線夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而減少自由基的生成[26]。

本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚胚胎對(duì)比研究了WBP和FWBP的抗氧化活性，結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的WBP和FWBP均顯著降低了斑馬魚體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制了斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，降低了胚胎的細(xì)胞死亡率。且與對(duì)照組相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP均引起斑馬魚胚胎SOD活性顯著升高，50～200 μg/mL的WBP和FWBP均顯著提高斑馬魚胚胎CAT和GSH-Px活性。表明麥麩多糖具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化作用，且當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)FWBP的抗氧化作用顯著強(qiáng)于WBP。已有大量研究利用斑馬魚氧化應(yīng)激模型證實(shí)多種植物多糖具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性[17,19,22,24]。如鄒婭雪等[27]利用斑馬魚模型研究瓊膠寡糖的抗氧化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖可通過清除體內(nèi)大量ROS生成和阻止細(xì)胞死亡以提高其體內(nèi)抗氧化功能。先前研究顯示，天然活性多糖中的單糖類小分子可通過還原高度氧化性的自由基，使自由基鏈鎖反應(yīng)終止，清除自由基，以達(dá)到抗氧化的效果[28]。麥麩多糖在體外具有羥基自由基和DPPH自由基清除能力已被證實(shí)[29]，這可能是WBP與FWBP具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化能力的原因。

多糖的抗氧化作用機(jī)制具有多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，多糖可通過提高體內(nèi)主要抗氧化酶的活性，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化功能[31]。斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激和抗氧化防御機(jī)制與哺乳動(dòng)物高度相似[32]，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)WBP與FWBP暴露后斑馬魚胚胎抗氧化酶活性顯著升高，表明麥麩多糖也可通過提高斑馬魚胚胎中SOD、CAT、GSH-Px等主要抗氧化酶的活性，進(jìn)而提高其抗氧化功能。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)，多糖可以通過Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)抗氧化酶基因及蛋白表達(dá)增加，從而提高其抗氧化作用[31]。如Sun等[32]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2-ARE信號(hào)通路的表達(dá)，提高心肌抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)前期研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵麥麩阿魏酰低聚糖可提高敵草快誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激大鼠肝臟和回腸Nrf2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及GSH-Px、CAT和SOD mRNA 表達(dá)水平，從而提高大鼠的抗氧化功能[21]，但關(guān)于WBP與FWBP發(fā)揮抗氧化功能的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 微生物發(fā)酵對(duì)麥麩多糖抗氧化活性的影響

微生物發(fā)酵法是生物改性法的一種，是指微生物在適宜條件下，將不能令人滿意的底物經(jīng)過特定的代謝途徑分解或轉(zhuǎn)化為相容組分的過程，被認(rèn)為可以修飾天然多糖的結(jié)構(gòu)特征，提高其生物活性[12,33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未發(fā)酵麥麩多糖組相比，200 μg/mL的發(fā)酵麥麩多糖暴露可顯著降低斑馬魚胚胎ROS產(chǎn)生量、脂質(zhì)過氧化率和細(xì)胞死亡率，提高仔魚的抗氧化能力，同時(shí)發(fā)酵麥麩多糖組胚胎抗氧化酶活性也顯著升高。表明經(jīng)微生物發(fā)酵后的麥麩多糖其體內(nèi)抗氧化活性顯著增強(qiáng)。已有研究顯示，多糖的抗氧化活性與其單糖組成、分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[34]。Zhang等[35]利用植物乳桿菌NCU116發(fā)酵蘆筍的研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸組成，蘆筍經(jīng)植物乳桿菌NCU116發(fā)酵后其單糖組成發(fā)生改變，其中鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸在的比例分別提高了46.70‰、114.09‰、12.75‰，發(fā)酵蘆筍多糖中檢測(cè)到葡萄糖醛酸，而未檢測(cè)到木糖，且發(fā)酵后蘆筍多糖分子質(zhì)量從181.3 ku降低到152.8 ku；且通過DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蘆筍多糖比蘆筍多糖對(duì)自由基的清除能力更強(qiáng)。劉燕等[36]利用紅曲菌對(duì)燕麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后燕麥多糖的單糖組成發(fā)生顯著變化，甘露糖和半乳糖比例明顯上升，葡萄糖略降低，鼠李糖未檢測(cè)到，且發(fā)酵后紅曲燕麥多糖清除羥基自由基和ABTS+自由基的能力及抑制淀粉酶活性的能力均高于未發(fā)酵燕麥多糖。本實(shí)驗(yàn)前期研究也發(fā)現(xiàn)，WBP和FWBP主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖組成，與WBP相比，F(xiàn)WBP中葡萄糖的摩爾比降低了65.31%，木糖和阿拉伯糖的摩爾比分別提高了65.79%和78.18%，且檢測(cè)到巖藻糖，同時(shí)發(fā)酵后FWBP(21.19 ku)的分子質(zhì)量較WBP(52.02 ku)顯著降低[31]。已有研究表明，葡萄糖與半乳糖比值較低的多糖具有較高的抗氧化活性[37]，本實(shí)驗(yàn)前期研究也證明FWBP的葡萄糖/半乳糖比值低于WBP，這可能是發(fā)酵后麥麩多糖具有更強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性的原因之一。另外多糖的分子質(zhì)量與其抗氧化活性密切相關(guān)，分子質(zhì)量的降低使其抗氧化能力進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，有研究顯示，富含羥基和糖醛酸的多糖具有更高的抗氧化能力[37,38]，本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)麥麩多糖進(jìn)行單糖組成分析也顯示FWBP中的羥基和糖醛酸含量比WBP中的含量高，這也可能是FWBP比WBP具有較高抗氧化功能的原因之一。

4 結(jié)論

高質(zhì)量濃度的WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育具有一定的毒性作用，主要表現(xiàn)為斑馬魚胚胎心率降低、死亡率提高、孵化率降低和初孵仔魚體長(zhǎng)減小。50～200 μg/mL的WBP和FWBP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響較小，可顯著降低斑馬魚體內(nèi)的ROS產(chǎn)生，細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過氧化率，提高斑馬魚胚胎中抗氧化酶的活性，從而提高胚胎的抗氧化能力，且FWBP的體內(nèi)抗氧化作用明顯優(yōu)于WBP。本研究結(jié)果表明麥麩多糖具有較強(qiáng)的抗氧化功能，發(fā)酵處理可提高其抗氧化作用，可以開發(fā)作為抗氧化劑。