宏基因組第二代測序技術診斷鸚鵡熱衣原體肺炎1 例

張祥欽，江 勇

（廣州醫(yī)科大學附屬深圳沙井醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣東 深圳 518000）

鸚鵡熱衣原體是一類專性細胞內(nèi)寄生的革蘭染色陰性病原體，主要感染鸚鵡、鴿子、雞、鴨等禽類，并可通過病鳥的干燥糞便、羽毛或呼吸道分泌物的氣溶膠，進入人體而造成人畜共患病[1]。相關文獻報道顯示，該病人傳人的現(xiàn)象較為罕見，人類感染鸚鵡熱衣原體后通常有5～14 d 的潛伏期，引起的臨床表現(xiàn)主要是高熱、干咳等與上呼吸道感染相似的癥狀，嚴重時可進展為非典型的重癥肺炎[2]。鸚鵡熱衣原體肺炎在臨床上并不常見，據(jù)文獻統(tǒng)計，其發(fā)病率約占社區(qū)獲得性肺炎病例的1%[3]，因此許多臨床醫(yī)師對其認識嚴重不足。另外，由于鸚鵡熱衣原體肺炎的流行病學資料不明確、臨床癥狀特異性差，且目前實驗室診斷方法局限，臨床上更容易造成誤診、誤治。宏基因組第二代測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一種新型的微生物檢測方法，可對臨床樣本的DNA 或RNA 進行測序以快速確定致病微生物，近年來逐漸被應用于臨床。有關利用mNGS 診斷鸚鵡熱衣原體肺炎的相關報道目前仍較少。本文報道1 例我院近期確診的鸚鵡熱衣原體肺炎病例，旨在提高臨床醫(yī)師對鸚鵡熱衣原體肺炎的認識，并探討mNGS在鸚鵡熱衣原體肺炎診治中的應用價值。

病例：患者為39 歲女性，因“發(fā)熱、尿灼熱感4 d”被收治入我院。入院前4 d，患者無明顯誘因下出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達39.8 ℃，畏寒，但無寒戰(zhàn)，發(fā)熱時伴有頭暈、頭痛，全身無力明顯，排尿時有灼熱感，伴腰痛，無明顯尿頻、尿急，偶有咳嗽，咳白痰。當時患者就診于我院，實驗室檢查示，白細胞計數(shù)7.83×109/L，血小板計數(shù)189×109/L，中性粒細胞百分比81.1%（↑），C 反應蛋白33.56 mg/ L（↑），超敏C 反應蛋白>5.00 mg/L（↑）。予對癥退熱治療后，患者的病情仍有反復，復診查尿常規(guī)示，尿液潛血+++，尿液白細胞弱陽性，尿液白細胞63.08 個/μL（↑）；查床邊生化示血鉀2.8 mmol/L，考慮診斷“急性腎盂腎炎、低鉀血癥”，收入我院腎內(nèi)科?；颊呒韧w健，否認疫區(qū)居留史。入院體格檢查示，體溫36.6 ℃，心 率66 次/min，呼吸20 次/min，血壓101/61 mmHg，神志清；心音有力，心律齊，未聞及心臟雜音；雙肺呼吸音對稱，雙肺呼吸音粗，未聞及干濕啰音；腹部平軟，無壓痛，無反跳痛；雙側腎區(qū)叩擊痛陰性。入院后予頭孢他啶抗感染及補鉀治療，患者仍有發(fā)熱，測得體溫最高達39.4 ℃。胸部X 線攝片顯示，左下肺炎；泌尿系+腹部+心臟彩超未見異常；大便常規(guī)及潛血、抗核抗體、甲狀腺功能三項、結核抗體、乙肝表面抗原、丙肝病毒IgG 抗體、梅毒螺旋體抗體、艾滋病毒抗原抗體未見異常。予加用莫西沙星覆蓋不典型病原菌感染治療，患者體溫無下降，最高達40.2 ℃，第2 天改用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉+莫西沙星抗感染，奧司他韋抗病毒治療。進一步查胸部CT示，患者左肺下葉各段見斑片狀密度增高影及實變影，邊緣較模糊，病灶內(nèi)見含氣支氣管影，余肺段紋理清晰（見圖1）。呼吸道病毒感染篩查為陰性。其后，患者轉入呼吸與危重癥醫(yī)學科，行纖維支氣管鏡檢查。將其肺泡灌洗液送至華大基因行PMseq-DNA 呼吸系統(tǒng)感染病原微生物第二代測序技術檢測（鄂漢械備：20190039 號），回報結果為，鸚鵡熱衣原體檢出序列數(shù)95 條reads，流產(chǎn)衣原體檢出序列數(shù)6 條reads（檢測到病原微生物1 條序列即判定為陽性，而檢測靈敏度與檢測總序列數(shù)呈正相關）?；颊咦罱K被診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎。明確診斷后，繼續(xù)予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉+莫西沙星抗感染治療（停用奧司他韋），方案調(diào)整后第2天其體溫逐漸下降，當晚體溫降至37.3 ℃以下，且未再升高。治療2 周后患者復查胸部CT 提示左肺下葉各段多發(fā)感染病灶較前明顯吸收（見圖2），治療有效。

圖1 治療前胸部CT 影像學表現(xiàn)

圖2 治療2 周后胸部CT 影像學表現(xiàn)

討論：雖然隨著各類抗生素類藥物的應用，鸚鵡熱衣原體感染后病例死亡的發(fā)生率已經(jīng)很大程度地降低。研究表明，目前鸚鵡熱衣原體感染住院病例的總體死亡率僅約為0.93%，死亡病例也主要集中在50 歲以上的中老年人群[4]，然而，本病患者除了可出現(xiàn)咳嗽等肺內(nèi)表現(xiàn)外，還可伴發(fā)一些非特異性肺外表現(xiàn)，例如腦膜炎、肝炎、心肌炎等[5]，另外早期的誤診誤治可增加患者的醫(yī)療支出及心理壓力，損害患者的身心健康。因此，早期快速、準確診斷該病仍然十分必要。

目前，大多數(shù)鸚鵡熱衣原體肺炎病例主要通過流行病學史、臨床表現(xiàn)和微量免疫熒光（micro-immunofluorescence，MIF）法檢測來進行診斷。但除了與病鳥直接接觸傳播外，間接的環(huán)境暴露同樣可造成鸚鵡熱衣原體感染[6]，因此該病的流行病學本身并不明確。本例報道的病例并無確切的鳥類接觸史或環(huán)境暴露史，而早期臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、腰痛等非特異性癥狀，使得輔助檢缺乏針對性，后期發(fā)現(xiàn)的胸部CT 的肺炎異常表現(xiàn)也并不具備特征性，因此實驗室檢查在其中顯得至關重要。但常規(guī)MIF 診斷鸚鵡熱衣原體的標準是，恢復期（發(fā)病2～4 周后）的鸚鵡熱衣原體抗體效價較急性期有4 倍或以上的升高。該診斷方法較傳統(tǒng)的補體結合試驗的靈敏度及特異度都要高，但同時也存在一定的局限。①該方法需要對急性期和恢復期的抗體效價均進行檢測對比才能明確診斷，因此可能會導致診斷延誤；②在該病的治療當中，使用抗生素有可能會導致抗體反應延遲或減弱，因此會使恢復期的抗體效價出現(xiàn)誤差[2]。由此可見，MIF 更適合在疾病恢復后進行回顧性診斷，在疾病早期的診療指導上作用有限。

mNGS 是通過對臨床樣本的DNA 或RNA 進行鳥槍法測序，對包括病毒、細菌、真菌及寄生蟲等多種病原微生物進行檢測，側重于微生物基因組的識別和分析[7]，具有高通量、低成本、自動化程度高等特征[8]。筆者將相關共識[7]建議在常規(guī)檢查的同時開展mNGS 檢測的人群總結為以下六類。①表現(xiàn)為發(fā)熱或發(fā)熱癥候群，病原體尚不明確，且經(jīng)驗性抗感染治療無效者；②不除外感染導致的急危重癥者；③免疫受損疑似繼發(fā)感染，病原體尚不明確，且經(jīng)驗性抗感染無效者；④疑似局部感染，且病原體尚不明確，可能引起嚴重后果者；⑤高度疑似感染，病原體尚不明確，且常規(guī)抗感染無效者；⑥慢性感染或慢性疾病不除外感染，且兩者難以鑒別，需明確病因者。本病例早期反復發(fā)熱且病原體不明，使用常規(guī)抗感染治療效果欠佳，因此有進行mNGS 檢查的指證。mNGS 可檢測病毒、細菌、真菌、寄生蟲等四大類，減少了特殊病原體、少見微生物的遺漏情況，使得檢測更加全面。然而，由于mNGS 是通過檢測到的樣本讀長（堿基序列）與數(shù)據(jù)文庫的參考基因進行比對而得出分析[7]，因此參考基因數(shù)據(jù)庫的微生物種類完整性直接影響到mNGS 的檢測能力，這對實驗室的微生物參考基因組的公共數(shù)據(jù)庫提出了很高要求，成為限制mNGS 目前未能廣泛普及的原因之一。通常微生物檢測的讀長數(shù)量（堿基序列數(shù)量）越多，那么其為致病微生物的可能性越大[7]，所以讀長數(shù)量在分析當中也可為臨床醫(yī)師提供參考，用于輔助判斷所檢測到的微生物是致病菌還是定植菌，抑或是樣本污染。本病例的二代基因測序結果顯示，鸚鵡熱衣原體檢出序列數(shù)95 條reads，流產(chǎn)衣原體檢出序列數(shù)6 條reads，因此認為鸚鵡熱衣原體是該病例的致病微生物的可能性大，結合患者的臨床表現(xiàn)及影像學表現(xiàn)，最后確定診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎。

鸚鵡熱衣原體感染患者治療首選四環(huán)素類藥物，而大環(huán)內(nèi)酯類藥物以及新喹諾酮類藥物同樣有效。本病例在后期經(jīng)驗性地選擇了加入莫西沙星治療，發(fā)熱得到了控制，但根據(jù)循證醫(yī)學原則也仍需要實驗室檢測去支持該治療方案。而mNGS 除了可對病原微生物進行鑒定之外，還可對病原體進行耐藥基因檢測，通過測序確定具體的耐藥基因在哪個病原體上，并且確定是在質粒上還是染色體上[7]，對臨床的治療指導有重大意義。此外，mNGS 技術憑借其在檢查新發(fā)病原體或一些特殊病原體當中的快速、明確、全面、徹底等優(yōu)勢，在感染性疾病流行暴發(fā)的臨床診治和疾病防控當中也有很高的應用價值[7，9]。但由于該技術目前缺乏標準的操作規(guī)范和可信的解釋標準，且檢驗的質量也參差不齊，因此尚未得到廣泛推廣。相信隨著研究的深入與行業(yè)規(guī)范的制定，該技術將在臨床實踐當中擁有廣闊的應用前景。

總之，在臨床上遇到不明病原體的社區(qū)獲得性肺炎患者時，需要注意詳細詢問流行病學史，并警惕鸚鵡熱衣原體感染可能。在常規(guī)檢查及經(jīng)驗性抗感染治療效果欠佳時，推薦將mNGS 檢測作為輔助診斷手段，達到早診斷、早治療的效果。