黃連解毒湯通過抑制TGF-β信號(hào)通路減輕2型糖尿病大鼠肝脂肪變性和纖維化研究

茍 芳 ,張紅軍 ,王 潔 ,張邱兵

(1.廣元市中心醫(yī)院,四川 廣元 628000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 瀘州 646000)

高血糖可引起糖原在肝臟堆積及肝臟微血管病變，損害肝功能，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)患者罹患非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[2]。更有研究者認(rèn)為，糖尿病是促進(jìn)肝臟疾病進(jìn)展和肝臟相關(guān)病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。進(jìn)行性脂肪沉積和肝纖維化是NAFLD的典型特征,除胰島素抵抗和高胰島素血癥外，肝臟中的脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致T2DM和NAFLD的進(jìn)展，并促進(jìn)肝臟纖維化和潛在的肝硬化[4]。在肝損傷及纖維化過程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信號(hào)通路起重要作用[5-6]。黃連解毒湯為中藥清熱劑，具有清熱解毒之功效，主治三焦火毒證[7-8]。以往的藥理研究表明[9]，黃連解毒湯在臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究中對(duì)肺炎、泌尿系感染、流行性腦脊髓膜炎、發(fā)熱等具有一系列有益作用。最新的研究表明[10]，黃連解毒湯對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥，如心血管疾病和糖尿病腎病也有作用。然而，其對(duì)T2DM時(shí)肝損傷的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究中，我們探討了黃連解毒湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟損傷的影響，以期為臨床合理用藥提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與干預(yù) 30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠150～170 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF環(huán)境，溫度22～25 ℃，濕度60%～70%，12 h/12 h明暗周期。黃連解毒湯由我院藥劑科制備。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)制定的指導(dǎo)方針。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組,n=10)和實(shí)驗(yàn)組(n=20)，造模前12 h禁食，實(shí)驗(yàn)組大鼠按照55 mg/kg 劑量的鏈脲佐霉素(Streptozocin，STZ)進(jìn)行腹腔注射，用高脂高糖飼料(標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加10%蔗糖、10%豬油硬脂、2%膽固醇和0.5%膽酸)喂養(yǎng)6周；NC組給予相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料6周。STZ注射7 d后，測(cè)空腹血糖，實(shí)驗(yàn)組以血糖水平13.5～25 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。 再將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM組,n=10)：給予同等量0.9%氯化鈉溶液灌胃；黃連解毒湯組(HL組,n=10)：按照2.44 g/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)，給予黃連解毒湯灌胃，連續(xù)4周。黃連解毒湯的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：大鼠劑量(g/kg)=9.1×人臨床劑量(0.067 g/kg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采血和組織制備：治療結(jié)束時(shí)，大鼠在隔夜禁食后被處死，經(jīng)大鼠眶后靜脈叢采血，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TCHO)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)等肝功能指標(biāo)。肝脂酶活性測(cè)定參照南京建成生物科技有限公司商品化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。用ABTS試劑盒測(cè)定肝組織總抗氧化能力，并按碧云天生物技術(shù)有限公司(中國(guó))試劑盒說(shuō)明檢測(cè)肝臟過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性。將大鼠肝組織與過量的H2O2混合3 min后，檢測(cè)剩余的H2O2，并以每分鐘H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧的量來(lái)測(cè)定CAT活性。用南京建成生物科技有限公司商品化試劑盒檢測(cè)血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等氧化應(yīng)激特異性標(biāo)志物。8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)的血清水平根據(jù)制造商的說(shuō)明使用商用試劑盒(中國(guó)武漢)進(jìn)行評(píng)估。肝標(biāo)本用10%中性甲醛固定，然后用梯度乙醇脫水，石蠟包埋進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.2.2 組織病理學(xué)檢查：固定和處理后的肝臟石蠟切片(4 μm)按說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)步驟分別用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)試劑、Masson三色試劑和油紅O染色。其他石蠟固定的肝標(biāo)本切成6 μm厚的切片，用苦味酸-天狼星紅(0.1%天狼星紅在飽和的苦味酸水溶液中)(Sigma，美國(guó))染色以檢測(cè)肝纖維化，主要以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為觀察值班。切片在顯微鏡下成像，每層隨機(jī)選取5幅圖像，用Image J軟件分析陽(yáng)性區(qū)域的光密度。

1.2.3 免疫組化染色：切片用二甲苯脫蠟，乙醇脫水?？乖迯?fù)在95 ℃檸檬酸鹽水中微波3 min，然后用3%過氧化氫處理25 min。用5%牛血清白蛋白封閉后，與兔抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗體或兔抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子CD681抗體(稀釋1∶1000)、3-硝基酪氨酸(3-NT)抗體(稀釋1∶500)4 ℃孵育過夜。切片與辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(中國(guó)武漢達(dá)科)室溫孵育50 min。用DAB染色觀察α-SMA、CD68的表達(dá)。然后在光學(xué)顯微鏡下檢查切片。隨機(jī)選擇5個(gè)圖像進(jìn)行數(shù)字采集(放大400倍)，并用Image J(NIH，Bethesda，MD)軟件對(duì)光密度進(jìn)行量化。

1.2.4 PCR檢測(cè)：參照操作說(shuō)明書提取組織標(biāo)本中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再擴(kuò)增成DNA，所有步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書操作。引物序列見表1，所有引物序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min結(jié)束。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)：肝組織勻漿在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冷RIPA緩沖液中。裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(Polyvinyllidene fluoride，PVDF)膜上。封閉后，免疫印跡分別與兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(稀釋1∶1000)、兔核轉(zhuǎn)錄因子-κB (Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)(稀釋1∶1000)抗體、兔TGF-β(稀釋1∶2000)抗體、兔Smad2/Smad3(稀釋1∶2000)抗體、兔Ⅰ型膠原抗體(稀釋1∶1000)孵育過夜，再用二抗山羊抗兔HRP(北京康明生物科技公司)進(jìn)行孵育。使用Chemi Doc-it 510成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和可視化。通過Quantity One軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃連解毒湯對(duì)糖尿病大鼠一般情況的影響 見表2。與NC組大鼠相比，DM組大鼠的體重增長(zhǎng)量較小，但食物和水的攝入量明顯增加。HL組大鼠治療后大鼠的體重增長(zhǎng)量有所增加，并改善了糖尿病大鼠的多飲和多食。同時(shí)，經(jīng)HL治療后，大鼠的空腹血糖水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 黃連解毒湯對(duì)糖尿病大鼠一般情況的影響

2.2 黃連解毒湯改善糖尿病大鼠肝臟形態(tài)和功能的影響 見表3(圖1)。與NC組相比，DM組大鼠肝臟肥大，肝指數(shù)及ALT、AST水平明顯升高，而HL組大鼠肝指數(shù)明顯降低，血清ALT、AST水平均明顯降低。HE染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組肝小葉損害嚴(yán)重，門脈周圍及間質(zhì)纖維結(jié)締組織增多。中央靜脈周圍有大量肝細(xì)胞脂肪變性。HL組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肝細(xì)胞組織化程度高，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，HL治療后明顯減輕了糖尿病肝脂肪變性的形態(tài)學(xué)改變。

表3 黃連解毒湯對(duì)糖尿病大鼠肝功能的影響

2.3 黃連解毒湯對(duì)糖尿病大鼠肝臟脂代謝紊亂及脂質(zhì)沉積的調(diào)節(jié)作用 見表4(圖2)。DM組大鼠血清TG、TCHO和LDL水平明顯高于NC組，而HDL明顯較低，經(jīng)HL干預(yù)后可有效改善糖尿病大鼠脂代謝紊亂。油紅O染色檢測(cè)顯示，DM組大鼠肝內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積。大量脂肪變性肝細(xì)胞在中央靜脈周圍呈斑點(diǎn)狀分布，病變較重。HL干預(yù)后在很大程度上改變了這種脂質(zhì)分布，中央靜脈周圍有較輕的脂肪變性肝細(xì)胞聚集。

圖2 黃連解毒湯對(duì)糖尿病大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響

2.4 黃連解毒湯抗肝纖維化的作用 Masson染色結(jié)果顯示，糖尿病大鼠肝組織中結(jié)締組織明顯增生，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量增加。小葉周圍膠原堆積，形成大的纖維間隔和假小葉。然而，在HL治療組的肝臟中這些病變明顯減輕。α-SMA免疫組化染色顯示，DM組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，分布于匯管區(qū)、纖維間隙。與DM組比較，HL組α-SMA表達(dá)降低。進(jìn)一步進(jìn)行天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)，DM組的Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平明顯高于NC組，而HL治療的糖尿病大鼠肝臟的Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平明顯降低(圖3)。

圖3 黃連解毒湯抗肝纖維化的作用

2.5 黃連解毒湯對(duì)肝臟糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 見表5。與DM組相比，HL治療有效地降低了糖異生關(guān)鍵酶Pck1和G6P基因的表達(dá)水平。與NC組大鼠相比，成脂關(guān)鍵基因如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(Srebp1c)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(Scd1)顯著上調(diào)，而β氧化關(guān)鍵基因，如過氧化物酶?；o酶A氧化酶2(ACOX2)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(Cpt1)基因表達(dá)下調(diào)，提示HL可顯著降低糖尿病大鼠肝臟成脂基因的表達(dá)，但對(duì)β-氧化作用影響不大。這表明，HL可預(yù)防肝臟脂肪變性，有效改善糖尿病大鼠肝臟糖代謝，減少新生脂肪生成。

表5 黃連解毒湯對(duì)肝臟糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 黃連解毒湯對(duì)糖尿病肝組織炎性反應(yīng)及信號(hào)通路的影響 見圖4、5(表6)。CD68免疫組化染色顯示，DM組大鼠肝臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，而HL干預(yù)可抑制這一過程。Western blot檢測(cè)顯示，DM組大鼠肝臟組織中p-NF-κB、TGF-β及p-Smad2/3表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。經(jīng)HL干預(yù)后，大鼠肝臟組織中p-NF-κB、TGF-β及p-Smad2/3表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖4 黃連解毒湯對(duì)糖尿病肝組織炎性反應(yīng)及信號(hào)通路的影響

圖5 黃連解毒湯對(duì)糖尿病肝組織信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

表6 黃連解毒湯對(duì)肝臟組織中p-NF-κB、TGF-β及Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝臟是脂肪生成、糖異生和膽固醇代謝的中心器官，T2DM患者的肝臟脂肪變性是游離脂肪酸攝取、合成、輸出和氧化失衡的結(jié)果[11]。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯具有穩(wěn)定的降血糖作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯對(duì)肝臟中糖異生酶如Pck1和G6P的基因表達(dá)也有一定影響。在2型糖尿病中，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致外周脂肪細(xì)胞發(fā)生脂解，形成游離脂肪酸釋放到血液中，并最終在肝臟中積累。通過油O紅染色，我們發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯顯著減少了肝臟中積累的脂肪。黃連解毒湯調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的作用與抑制脂肪生成有關(guān)，Scd1基因表達(dá)下調(diào)證明了這一點(diǎn)。此外，Srebp1c已被確認(rèn)為胰島素和葡萄糖對(duì)糖酵解和脂肪生成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的中介[12]。在本研究中，黃連解毒湯對(duì)Srebp1c的表達(dá)也有抑制作用。肝脂酶是與血清甘油三酯水平相關(guān)的關(guān)鍵酶，肝脂酶的降低會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)清除障礙，從而導(dǎo)致外周血中甘油三酯的積累。

糖尿病環(huán)境下的脂質(zhì)代謝紊亂，如TCHO、TG和LDL增加，以及肝臟中大量沉積的脂質(zhì)，將導(dǎo)致失衡的氧化應(yīng)激反應(yīng)。根據(jù)著名的“兩次打擊”假說(shuō)，炎癥會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)結(jié)構(gòu)和功能損害[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟中氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，經(jīng)過干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯對(duì)肝臟脂質(zhì)堆積有明顯的抑制作用。此外，它還減少了隨后MDA的積累，防止進(jìn)一步的DNA氧化損傷，并提高糖尿病肝臟的抗氧化能力。肝細(xì)胞中的脂質(zhì)過載促進(jìn)氧化應(yīng)激的加劇，氧化應(yīng)激通過釋放白介素和單核細(xì)胞趨化蛋白促進(jìn)炎癥狀態(tài)，隨后，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)活化，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的進(jìn)一步釋放[14]。在本研究中，我們通過驗(yàn)證巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的升高來(lái)證實(shí)糖尿病肝臟炎癥的增加。先前研究也表明黃連解毒湯的體外抗炎作用[15]。在目前的研究中，這種抗炎作用主要體現(xiàn)在減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。炎癥小體的激活是啟動(dòng)炎癥的重要機(jī)制，NF-κB可通過激活信號(hào)通路和TLR來(lái)促進(jìn)炎性小體成分的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)激中起著關(guān)鍵作用[16]。有研究者報(bào)道稱[17]，肥胖和高脂飲食會(huì)導(dǎo)致肝臟中NF-κB活性顯著升高，在我們的研究中也觀察到了這一點(diǎn)。經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后，顯著下調(diào)了糖尿病大鼠肝組織中NF-κB的大量活化，這可能是其抑制糖尿病肝臟炎癥的機(jī)制之一。

肝纖維化是慢性肝損傷的常見結(jié)果，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的異常沉積[18]。在本研究中，天狼星紅染色和Masson染色顯示糖尿病大鼠的膠原蛋白明顯增加。這主要是由于慢性高血糖和肝臟中的脂質(zhì)紊亂通過炎癥和氧化應(yīng)激造成的傷害。糖尿病不僅會(huì)加速肝臟炎癥，導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝功能衰竭，而且可能會(huì)增加細(xì)菌感染的發(fā)生率。炎癥細(xì)胞因子在纖維化中起關(guān)鍵作用。因此，糖尿病條件下的持續(xù)性炎癥幾乎總是先于纖維化。持續(xù)性肝纖維化可進(jìn)展為肝硬化，最終導(dǎo)致器官衰竭和死亡。黃連解毒湯通過降低細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量而發(fā)揮抗纖維化作用。肝星狀細(xì)胞是肝臟特異性間充質(zhì)細(xì)胞，在肝纖維化形成中起關(guān)鍵作用。肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件[19]。在本研究中，我們觀察到α-SMA在糖尿病肝組織中的高表達(dá)，它是肝星狀細(xì)胞活化的生物標(biāo)志物。黃連解毒湯可通過降低α-SMA的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化。TGF-β是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中最重要的因素。因此，本研究主要圍繞TGF-β/Smad信號(hào)通路來(lái)解釋黃連解毒湯抑制肝纖維化的機(jī)制。TGF-β與其受體結(jié)合后，Smad2/3發(fā)生磷酸化并被激活，然后與Smad4結(jié)合移位到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)染色質(zhì)復(fù)合體的形成，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可通過減輕氧化應(yīng)激和抑制炎癥，減輕2型糖尿病大鼠的肝臟脂質(zhì)沉積和肝纖維化。這種對(duì)糖尿病肝損傷的保護(hù)作用與抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路和抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。