氯米芬微刺激方案中成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎的預(yù)測(cè)因子分析

朱媛，易善玲，周建軍

控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）的目的是誘導(dǎo)多個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，以期獲得合適數(shù)量的卵母細(xì)胞，從而提高妊娠率[1]。常采用的長(zhǎng)方案、拮抗劑方案等需給予較大劑量的外源性促性腺激素（gonadotropins，Gn）進(jìn)行促排卵，可相對(duì)提高獲卵數(shù)及每個(gè)促排卵周期的妊娠率，但是使用大劑量Gn促排卵是超生理的，同時(shí)增加卵巢過(guò)度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。微刺激方案因Gn用藥量小、更符合卵泡發(fā)育的生理狀態(tài)和治療時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)被逐漸采用，常用于基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）高或基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicle count，AFC）較少的卵巢儲(chǔ)備功能下降的患者，但是一些卵巢儲(chǔ)備功能正常的患者也可采用微刺激方案，如常規(guī)COS卵巢低反應(yīng)、反復(fù)胚胎質(zhì)量差和一些有特殊情況需先儲(chǔ)存胚胎的患者[2]。

2007年國(guó)際溫和方案輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)（International Society for Mild Approaches in Assisted Reproduction，ISMAAR）曾提出微刺激方案可作為常規(guī)促排卵的替代方案。微刺激方案使用較低劑量Gn獲得較少卵母細(xì)胞，目的是最大化利用獲得的高質(zhì)量卵母細(xì)胞/胚胎。與傳統(tǒng)COS方案相比，微刺激方案使用較低劑量Gn可以縮短治療時(shí)間，減輕患者取卵時(shí)的疼痛不適，顯著降低OHSS發(fā)生率，同時(shí)單次促排卵費(fèi)用減少，使患者對(duì)體外受精（in vitro fertilization，IVF）治療的接受度提高。也有研究表明，微刺激方案獲得的胚胎質(zhì)量可能更好，盡管與常規(guī)方案相比，微刺激方案每個(gè)周期的臨床妊娠率較低，但兩種卵巢刺激方案的累積妊娠率相當(dāng)[3]。

目前枸櫞酸氯米芬（clomiphene citrate，CC）和來(lái)曲唑（letrozole，LE）是微刺激方案中的常用藥物，其應(yīng)用可以減少卵巢低反應(yīng)患者的Gn用量并降低卵巢儲(chǔ)備功能正?；颊叩腛HSS發(fā)生率[4]。其中最常用的微刺激方案是單獨(dú)使用CC或聯(lián)合人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）。CC具有較強(qiáng)的抗雌激素作用和弱雌激素活性，可以通過(guò)與下丘腦中的雌激素受體結(jié)合，抑制內(nèi)源性雌激素對(duì)下丘腦的負(fù)反饋，增加內(nèi)源性Gn的水平，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育[5]。同時(shí)CC也可以與子宮內(nèi)膜的雌激素受體結(jié)合，影響子宮內(nèi)膜容受性，降低胚胎著床率[6]。隨著胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展，目前采用氯米芬微刺激方案獲得高質(zhì)量胚胎后通常進(jìn)行全胚胎冷凍，以避免新鮮周期移植時(shí)氯米芬對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，因此，是否獲得成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎是評(píng)價(jià)該方案是否成功的關(guān)鍵指標(biāo)。目前關(guān)于氯米芬微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎預(yù)測(cè)因子的研究較少，本研究旨在探討患者基本情況、促排卵參數(shù)與獲得成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎的相關(guān)性，從而為該方案的促排卵提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2014年1月—2015年12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院（我院）生殖醫(yī)學(xué)中心采用氯米芬微刺激方案促排卵行IVF/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：在此期間所有采用氯米芬微刺激方案促排卵、獲卵數(shù)≥1個(gè)且擬全胚胎冷凍的IVF/ICSI患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：采用LE促排卵、長(zhǎng)方案、拮抗劑方案及其他方案者；未獲卵患者。研究共納入1 029個(gè)周期。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批準(zhǔn)編號(hào)：2019-052-01），所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 氯米芬微刺激方案促排卵根據(jù)患者的AFC和性激素水平，在月經(jīng)的第2～4天開始使用CC（塞浦路斯高特制藥有限公司）50 mg/d，適時(shí)添加HMG 75 U/d（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）。當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到18 mm左右時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）5 000 U誘導(dǎo)卵泡成熟。hCG注射后約36 h，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

1.3 IVF/ICSI治療根據(jù)精子的狀態(tài)及前次IVF受精情況，采用IVF或ICSI受精。將帶卵丘放射冠的卵母細(xì)胞去除顆粒細(xì)胞后于倒置顯微鏡下觀察成熟情況，第一極體排出判定為卵母細(xì)胞成熟。受精后（17±1）h評(píng)估受精率。優(yōu)質(zhì)受精卵母細(xì)胞是球形的，2個(gè)極體和2個(gè)原核并排位于中心。根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）指南對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。在受精后（68±1）h評(píng)估第3天（D3）胚胎，將有7～12個(gè)卵裂球、碎片率少于15%且非多核受精的胚胎冷凍保存。分別在受精后（116±2）h和（140±2）h評(píng)估D5和D6的囊胚。參照人類囊胚的評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞（trophoblast cell，TE）、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）等級(jí)和發(fā)育階段對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)其等級(jí)優(yōu)于4CC時(shí)，冷凍保存囊胚，4CC囊胚則不予冷凍保存。本研究中的患者均采用全胚胎冷凍后凍融胚胎移植，不行新鮮胚胎移植。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。定性資料采用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析獲得成熟卵母細(xì)胞和可移植胚胎的相關(guān)預(yù)測(cè)因子，并計(jì)算出每個(gè)因子的比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（credibility interval，CI）。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析單個(gè)卵泡發(fā)育周期hCG注射日血清雌二醇（estradiol，E2）水平預(yù)測(cè)獲得可移植胚胎的價(jià)值。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯米芬微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞的預(yù)測(cè)因子本研究共納入1 029個(gè)氯米芬微刺激方案且成功獲卵的IVF/ICSI周期，根據(jù)是否獲得成熟卵母細(xì)胞分為獲成熟卵母細(xì)胞組（916個(gè)周期）和未獲成熟卵母細(xì)胞組（113個(gè)周期）。與未獲成熟卵母細(xì)胞組比較，獲成熟卵母細(xì)胞組的基礎(chǔ)FSH水平低，hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑較大，hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)較多，hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而2組患者的年齡、基礎(chǔ)黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）水平、基礎(chǔ)E2水平、基礎(chǔ)催乳素（prolactin，PRL）水平、基礎(chǔ)睪酮水平、基礎(chǔ)AFC、使用HMG者比例及促排卵時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 獲成熟卵母細(xì)胞組和未獲成熟卵母細(xì)胞組的基本情況及促排卵參數(shù)比較

進(jìn)一步將P＜0.1的6項(xiàng)因素（年齡、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)AFC、hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)和hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平）采用多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑（OR=1.231，95%CI：1.028～1.474，P=0.024）、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)（OR=2.443，95%CI：1.757～3.397，P＜0.001）、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平（OR=1.000，95%CI：1.000～1.001，P=0.003）是氯米芬微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其中hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)的OR值大于1，即hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑越大、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)越多，獲得成熟卵母細(xì)胞的可能性越大。而與卵巢儲(chǔ)備功能密切相關(guān)的指標(biāo)如年齡、基礎(chǔ)FSH水平和AFC均不是氯米氛微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。見表2。

表2 獲得成熟卵母細(xì)胞的多因素Logistic回歸分析

2.2 氯米芬微刺激方案獲得可移植胚胎的預(yù)測(cè)因子根據(jù)是否獲得可移植胚胎將1 029個(gè)周期分為獲可移植胚胎組（622個(gè)周期）和未獲可移植胚胎組（407個(gè)周期）。與未獲可移植胚胎組比較，獲可移植胚胎組的基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH水平較低，使用HMG者比例較高，hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑較大，hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而2組患者的年齡、配偶年齡、基礎(chǔ)PRL水平、基礎(chǔ)E2水平、基礎(chǔ)PRL水平、基礎(chǔ)睪酮水平、基礎(chǔ)AFC、促排卵時(shí)間和hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 獲可移植胚胎組和未獲可移植胚胎組的基本情況及促排卵參數(shù)比較

進(jìn)一步將P＜0.1的5個(gè)因素（基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)LH水平、使用HMG者比例、hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)）進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑（OR=1.106，95%CI：1.009～1.213，P=0.031）和hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)（OR=1.226，95%CI：1.100～1.366，P＜0.001）是氯米芬微刺激方案獲得可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，兩者OR值大于1，即hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑越大、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)越多，獲得可移植胚胎的可能性越大。

2.3 氯米芬微刺激方案中單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的預(yù)測(cè)因子本研究的1 029個(gè)周期中有382個(gè)周期在hCG日只有1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡，將這382個(gè)周期根據(jù)是否獲得可移植胚胎分為獲可移植胚胎組（168個(gè)周期）和未獲可移植胚胎組（214個(gè)周期）。與未獲可移植胚胎組比較，獲可移植胚胎組的hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡直徑較大，hCG日E2水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。2組患者的年齡、配偶年齡、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)LH水平、基礎(chǔ)E2水平、基礎(chǔ)PRL水平、基礎(chǔ)睪酮水平、基礎(chǔ)AFC、使用HMG者比例和促排卵時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4。

表4 單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲可移植胚胎組和未獲可移植胚胎組的基本情況及促排卵參數(shù)比較

將P＜0.1的3個(gè)因素（配偶年齡、hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和hCG日E2水平）進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，hCG日E2水平是單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（OR=1.000，95%CI：1.000～1.001，P=0.018）。

進(jìn)一步采用ROC曲線分析hCG日E2水平對(duì)氯米芬微刺激方案中單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，最佳臨界值為1 931.25 pmol/L，ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.605，預(yù)測(cè)獲得可移植胚胎的敏感度為74.4%，特異度為46.3%。見圖1。根據(jù)hCG日E2水平的最佳臨界值將這些周期分為2組，高于最佳臨界值組的hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和可移植胚胎率高于低于最佳臨界值組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。2組患者的年齡、配偶年齡、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)LH水平、基礎(chǔ)E2水平、基礎(chǔ)PRL水平、基礎(chǔ)睪酮水平、基礎(chǔ)AFC、使用HMG者比例和促排卵時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表5。

表5 單個(gè)卵泡發(fā)育周期hCG日E2水平高于最佳臨界值組和低于最佳臨界值組的基本情況及促排卵參數(shù)比較

圖1 hCG日E2水平對(duì)單個(gè)卵泡發(fā)育周期中獲得可移植胚胎的ROC曲線

3 討論

近年來(lái)，由于可以降低OHSS風(fēng)險(xiǎn)，減輕患者在治療過(guò)程中的不適感以及單次IVF的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，氯米芬微刺激方案被逐漸接受[7-8]。研究顯示，微刺激方案的胚胎非整倍體發(fā)生率顯著低于長(zhǎng)方案[9]。且采用氯米芬方案和常規(guī)方案促排卵后行IVF/ICSI的妊娠率和活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10-11]。但由于微刺激方案的單個(gè)促排卵周期獲卵數(shù)少，所以獲得成熟卵母細(xì)胞和可移植胚胎是評(píng)價(jià)該方案促排卵是否成功的關(guān)鍵指標(biāo)。因此本研究納入成功獲卵的患者資料，分析氯米芬微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎的預(yù)測(cè)因子，以期指導(dǎo)促排卵。

3.1 氯米芬微刺激方案獲得成熟卵母細(xì)胞的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子研究顯示獲卵率與卵泡直徑呈正相關(guān)[12]，取卵當(dāng)天，從直徑＞18 mm卵泡中獲得成熟卵母細(xì)胞的可能性比從直徑13～15 mm的卵泡中獲取高70%[13]。本研究結(jié)果與這些前期研究基本一致，即hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑大則獲得成熟卵母細(xì)胞概率高。研究表明隨著優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)增加，獲得成熟卵母細(xì)胞增多。本研究與以往研究結(jié)果基本一致，氯米芬微刺激方案hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)與獲得成熟卵母細(xì)胞的概率呈正相關(guān)。本研究氯米芬微刺激方案hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平與獲得成熟卵母細(xì)胞相關(guān)。但是hCG日優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平的OR值只有1.000，所以促排卵過(guò)程中并不是卵泡越大、E2水平越高越好，需綜合考慮選擇合適的扳機(jī)時(shí)機(jī)。

3.2 氯米芬微刺激方案獲得可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子既往研究表明，從直徑＞18 mm的卵泡中獲得卵母細(xì)胞形成的胚胎評(píng)分更高，且優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)越多獲得可移植胚胎的概率越大。本研究發(fā)現(xiàn)hCG日最大優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)是氯米芬微刺激方案中獲得可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，這與以往的研究結(jié)果一致，提示在合適情況下優(yōu)勢(shì)卵泡大、增加獲卵數(shù)可以提高獲得可移植胚胎的概率。本研究顯示，與卵巢儲(chǔ)備功能密切相關(guān)的指標(biāo)如年齡、基礎(chǔ)FSH水平和基礎(chǔ)AFC均不是獲得成熟卵母細(xì)胞及可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，這可能與本研究的人群選擇偏倚有關(guān)，本研究排除了未獲卵的患者。

3.3 氯米芬微刺激方案中單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子有研究顯示，血清/卵泡E2水平的提高與卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的提高呈正相關(guān)[14-15]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，在較少卵泡發(fā)育的IVF周期中可以通過(guò)血清類固醇水平來(lái)監(jiān)測(cè)卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育[16]。本研究進(jìn)一步分析單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的預(yù)測(cè)因子發(fā)現(xiàn)，hCG日E2水平是評(píng)估卵泡成熟度的較佳臨床指標(biāo)。通過(guò)ROC曲線分析單個(gè)卵泡發(fā)育周期獲得可移植胚胎的hCG日E2水平最佳臨界值后發(fā)現(xiàn)，高于最佳臨界值組的可移植胚胎率顯著高于低于最佳臨界值組。因此在單個(gè)卵泡發(fā)育周期中通過(guò)監(jiān)測(cè)E2水平在合適時(shí)機(jī)扳機(jī)可獲得較好結(jié)局。

3.4 本研究的局限性本研究屬于回顧性研究，需要通過(guò)前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果的臨床應(yīng)用有效性。本研究沒(méi)有對(duì)采用微刺激方案促排卵的原因進(jìn)一步分層分析，因?yàn)榉磸?fù)胚胎質(zhì)量差的患者獲得可移植胚胎的概率可能較其他原因患者低。本研究均納入全胚胎冷凍患者，有一些患者經(jīng)歷多次取卵后行凍融胚胎移植，所以無(wú)法評(píng)價(jià)這些周期參數(shù)的妊娠結(jié)局。

綜上所述，采用氯米芬微刺激方案，在合適的情況下，優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)及單個(gè)卵泡發(fā)育時(shí)hCG日E2水平可用于預(yù)測(cè)獲得可移植胚胎的概率，但仍需進(jìn)一步大樣本前瞻性研究證實(shí)。