秦皇島綠潮暴發(fā)區(qū)微觀繁殖體的時空分布特征及影響因素

馬曉君,李 艷,3,韓紅賓,宋 偉,3,王宗靈,3*

(1.自然資源部 第一海洋研究所,山東 青島 266061;2.自然資源部 海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266061;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237)

綠潮是由機(jī)會型大型綠藻過度增殖和生長而導(dǎo)致的一種生態(tài)災(zāi)害[1-2],常發(fā)生在水體富營養(yǎng)化的海域[3-4]。20世紀(jì)60年代以來,綠潮在世界許多沿海地區(qū)頻繁暴發(fā)[5-8]。2007年開始在中國黃海海域暴發(fā)的滸苔綠潮被認(rèn)為是世界上最大規(guī)模的綠潮[9-10]。該綠潮暴發(fā)時,大量綠藻堆積在岸灘上及水體中,腐爛時消耗氧氣并產(chǎn)生硫化物[11],使得浮游生物和魚類難以生存,并嚴(yán)重破壞當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境[12],造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[10,13]。2015年,秦皇島近岸海域出現(xiàn)了一種異于黃海綠潮的本地起源型綠潮。此后,每年4月至9月,綠潮在秦皇島鴿子窩至湯河口近岸海域暴發(fā),其中金夢海灣受災(zāi)最為嚴(yán)重。綠潮暴發(fā)期間,大型綠藻大量懸浮在距岸0～10 m的潮間帶以及潮下帶的淺水區(qū)域中,種類主要包括孔石莼(Ulva pertusa)、羽藻(Bryopsis plumosa)和滸苔(Ulva prolifera)[14]。Song等[15]于2019年對比懸浮海藻和該海域定生海藻的種類,基本確定秦皇島綠潮的藻源為海藻床中定生綠藻。但是,對于秦皇島綠潮的種源基礎(chǔ)和關(guān)鍵的發(fā)生過程,目前尚不清楚。

微觀繁殖體常作為種源基礎(chǔ)在綠潮連續(xù)暴發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。綠藻微觀繁殖體具有適應(yīng)低溫、低光照等生物學(xué)特性[16-17],當(dāng)遭遇不利環(huán)境時,大型綠藻會釋放出大量孢子和配子,與處于顯微階段的個體以及具有生長能力的藻體碎段共同形成微觀繁殖體庫,從而度過寒冬[18-19]。針對黃海海域的微觀繁殖體,大量研究[3-4,17,20-24]表明,微觀繁殖體在黃海海域的水體和沉積物中廣泛分布,具有明顯的時空分布特征[4,17,21-22]。在環(huán)境條件適宜時,綠藻微觀繁殖體在蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖筏架上附著生長為幼苗[22],成為定生綠藻的種源基礎(chǔ),從而影響黃海綠潮的形成及發(fā)生規(guī)模。

與黃海相比,有關(guān)秦皇島海域綠藻微觀繁殖體的研究較少。Han等[25]于2019年研究表明:水體中的綠藻微觀繁殖體主要分布在近岸,外海豐度顯著降低;每年7月和8月微觀繁殖體豐度最高,冬季最低。除了水體中,綠潮發(fā)生海域的沉積物中被證實(shí)常分布有高豐度的綠潮微觀繁殖體[17],但目前秦皇島海域沉積物中的綠藻微觀繁殖體尚未被報道。

為探索綠藻微觀繁殖體在秦皇島海域綠潮暴發(fā)中的作用,查明秦皇島綠潮的發(fā)生原因,本文對秦皇島綠潮暴發(fā)區(qū)水體和沉積物中的微觀繁殖體時空特征及影響因素開展研究,以期為進(jìn)一步闡明秦皇島綠潮發(fā)生的關(guān)鍵過程及防災(zāi)減災(zāi)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

在秦皇島受綠潮影響最為嚴(yán)重的金夢海灣布設(shè)6個站位(站位號為1、2、3、4、5、6,圖1)。站位1～3位于蓮花島與岸灘之間的近岸海域,該區(qū)域在綠潮暴發(fā)期間有懸浮滸苔分布;站位4和5位于蓮花島附近海域,此處有大型綠藻定生;站位6離岸較遠(yuǎn),在現(xiàn)場調(diào)查時幾乎沒有大型綠藻分布。

圖1 采樣區(qū)域和站位Fig.1 Sampling area and stations

于2020年5月至9月按照GB/T 12763.6—2007《海洋調(diào)查規(guī)范:第6部分 海洋生物調(diào)查》[26]中小型底棲生物調(diào)查所規(guī)定的采樣方法進(jìn)行逐月取樣。由潛水員手執(zhí)直徑為30 cm的圓柱形取樣器在每個取樣站位取10 cm長的沉積物樣,立刻置于4℃的冰箱中冷藏保存,然后將其運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。用分樣鏟將樣品按照沉積物深度劃分為[0,2)cm、[2,5)cm、[5,10)cm后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 環(huán)境參數(shù)測定

使用便攜式環(huán)境參數(shù)儀(美國YSI公司,556MPS型號)現(xiàn)場測定調(diào)查海域的溫度和鹽度。溶解氧(dissolved oxygen,DO)的質(zhì)量濃度按照Winkler法進(jìn)行現(xiàn)場測定[27],根據(jù)氧溶解度方程式計(jì)算飽和溶解氧質(zhì)量濃度并進(jìn)一步得到溶解氧飽和度[28]。

將采集的水樣經(jīng)孔徑為0.45μm混合纖維素酯濾膜(英國Whatman公司,直徑47 mm)過濾后低溫保存,然后帶至自然資源部第一海洋研究所海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等待測定。利用GB/T 17378.1—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范:第4部分 海水分析》[29]中鋅-鎘還原法和磷鉬藍(lán)法分別測定硝酸鹽和磷酸鹽的濃度。

1.3 沉積物與水體中綠藻微觀繁殖體的培養(yǎng)與定量

將采集的沉積物樣品中的除泥沙以外的附著基以及可見藻段挑除。首先,在[0,2)cm、[2,5)cm、[5,10)cm層分別取濕重為2 g的沉積物(設(shè)置3個平行,即每層取3次等質(zhì)量的沉積物樣品)加入到滅菌燒杯中。然后,向燒杯中加入1 L滅菌海水和20 m L PES培養(yǎng)液[30],再加入1 m L二氧化鍺溶液(GeO2,終質(zhì)量濃度為0.5 mg/L)以抑制硅藻生長。最后,將燒杯置于溫度為20℃、光輻射為80～100μmol/(m2·s)、光周期為12 L:12 D的智能人工氣候室(寧波江南儀器廠,202728-380型號)中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,每5 d添加一次PES營養(yǎng)液。

采集的水樣經(jīng)孔徑200μm的篩絹過濾后,加入到1 L的滅菌燒杯中(設(shè)3個平行)。培養(yǎng)條件與沉積物培養(yǎng)條件一致。

待沉積物樣品和海水樣品中培養(yǎng)出的綠藻幼苗生長至1～3 cm(培養(yǎng)時間約20 d)時,用消毒鑷子取出幼苗,在放大鏡下觀察幼苗形態(tài)并計(jì)數(shù)。之后,隨機(jī)挑選25株綠藻幼苗,對其用去離子水沖洗2～3次,置于1.5 m L滅菌離心管中冷凍保存,以備種類鑒定。

1.4 微觀繁殖體的DNA提取和種類鑒定

將凍存的離心管取出,置于室溫中。向離心管中加入500μL CSPL緩沖液,然后將離心管中的幼苗用高通量組織研磨器磨碎,以備提取DNA。

使用Omega植物基因提取試劑盒提取綠藻幼苗的全基因組DNA。選用ITS序列區(qū)分滸苔/緣管滸苔與其他綠藻常見種(如曲滸苔Ulva flexuosa等);以5S核糖體基因間隔區(qū)序列來區(qū)分滸苔和緣管滸苔。ITS和5S引物序列及PCR條件設(shè)置分別參考Leskinen和Pamilo[31]以及Hayden等[32]和Shimada[33]等。將所得產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序,對測得序列進(jìn)行比對,再與GenBank中的相似序列一起進(jìn)行Clustal W多重比對分析[34],進(jìn)而構(gòu)建ML進(jìn)化樹[35]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0軟件分析微觀繁殖體的數(shù)量差異,采用線性插值法補(bǔ)充缺失數(shù)據(jù),利用雙因素方差分析(two-way AVONA)方法分析不同季節(jié)和站位的綠藻微觀繁殖體豐度的差異,P＜0.05時,表示差異顯著。同時,利用T-檢驗(yàn)(T-test)比較2個月、2個站位以及沉積物的2個分層的綠藻微觀繁殖體豐度差異性,P＜0.05時,表明差異顯著。

為了探究不同因素對綠藻微觀繁殖體豐度的影響,利用Canoco 5軟件對綠藻微觀繁殖體豐度和大型海藻生物量及環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子變化

2020年5月至9月,金夢海灣海域的溫度、鹽度、磷酸鹽濃度、可溶性無機(jī)氮(dissolved inorganic nitrogen,DIN)濃度、溶解氧(DO)質(zhì)量濃度、溶解氧飽和度變化趨勢如圖2所示。溫度和磷酸鹽濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,溶解氧(DO)質(zhì)量濃度及溶解氧飽和度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,鹽度和可溶性無機(jī)氮的濃度變化不顯著。調(diào)查海域的溫度變化范圍為17.84～27.80℃,其中,6月至9月該海域的溫度維持在20℃以上,適宜大型綠藻的生長和繁殖;PO4-P濃度維持在較低的水平,為0.07～0.42μmol/L;溶解氧質(zhì)量濃度為6.03～11.08μg/L,其在7月最低(P＜0.05);平均DO飽和度均高于100%,均值為129%～212%,最低值同樣出現(xiàn)在7月;在調(diào)查期間鹽度變化不顯著;DIN的平均濃度范圍為22.64～30.51μmol/L,各月之間差異不顯著(P＞0.05)。該海域在調(diào)查期間的DIN含量較高,可以為大型綠藻的生長和微觀繁殖體的釋放提供充足的氮源。

圖2 2020年5月至9月秦皇島金夢海灣海域環(huán)境因子變化Fig.2 Temporal variation of environmental factors from May to September,2020

2.2 水體中微觀繁殖體的時空分布特征

分析水體中綠藻微觀繁殖體的豐度可知,各采樣站位水體中綠藻微觀繁殖體豐度均較低,為0～4株/L。綠藻微觀繁殖體呈現(xiàn)隨離岸距離增加而逐漸降低的空間分布特征,在金夢海灣海域離岸較近的站位(站位1～3)發(fā)現(xiàn)了較多的綠藻微觀繁殖體,而在蓮花島以外離岸較遠(yuǎn)的水體中卻少有綠藻微觀繁殖體分布,除站位4在6月及站位5在9月的微觀繁殖體豐度為1株/L外,其余各月站位4～6的微觀繁殖體豐度均為0株/L(圖3)。近岸不同采樣站位(站位1～3)之間綠藻微觀繁殖體豐度的差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 水體中綠藻微觀繁殖體豐度的空間分布Fig.3 Spatial distribution of micro-propagules in the sea water

在時間分布上,水體中綠藻微觀繁殖體總豐度最高值出現(xiàn)在6月,為10.5株/L;最低值出現(xiàn)在7月和8月,均為3株/L(圖4)。

圖4 水體中綠藻微觀繁殖體豐度的時間分布Fig.4 Temporal variation of micro-propagules in the surface water

2.3 沉積物中微觀繁殖體的時空分布特征

在空間分布上,經(jīng)對比各站位綠藻微觀繁殖體的豐度可知,距離岸灘最近的采樣站位(站位1～3)0～10 cm深度沉積物中的綠藻微觀繁殖體豐度的總和顯著高于其他采樣站位(P＜0.05),在離岸遠(yuǎn)的3個采樣站位(站位4～6)的沉積物中的綠藻微觀繁殖體的豐度卻極小。所以,0～10 cm深度的沉積物中綠藻微觀繁殖體的豐度總和在空間分布上也呈隨離岸距離增加而逐漸降低的趨勢(圖5),這與水體中的綠藻微觀繁殖體豐度的空間分布特征相似。深度為10 cm沉積物中微觀繁殖體豐度總和的分布除了在各站位之間存在差異之外,在垂直方向上也存在分布上的差異(圖6),深度為5 cm表層沉積物中綠藻微觀繁殖體的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于深于5 cm沉積物中的微觀繁殖體豐度。在8月和9月,由于綠藻微觀繁殖體分布較少,其豐度在垂直方向上沒有顯著的分布特征(P＞0.05)。

圖5 沉積物中綠藻微觀繁殖體豐度的空間分布Fig.5 Spatial distribution of micro-propagules in the sediment

圖6 綠藻微觀繁殖體在沉積物中的垂直分布Fig.6 Virtical distribution of micro-propagules in the sediment

綠藻微觀繁殖體的時間分布如圖7所示。沉積物中綠藻微觀繁殖體在6月的豐度最高(148株/g),在8月和9月的豐度較低(分別為2株/g和10株/g),而在7月的豐度為0。沉積物中綠藻微觀繁殖體的豐度在不同月份之間存在較大差異,與水體中綠藻微觀繁殖體豐度的時間分布不同。

圖7 2020年5月至9月沉積物中綠藻微觀繁殖體豐度變化Fig.7 Temporal variation of micro-propagules in the sediment

2.4 綠藻微觀繁殖體的種類組成

經(jīng)水體及沉積物培養(yǎng)出的幼苗的分子鑒定結(jié)果如圖8所示。其中,5月、6月、8月和9月培養(yǎng)得到的沉積物中的綠藻微觀繁殖體的種類組成分別用S-5、S-6、S-8、S-9表示,水體中綠藻微觀繁殖體的種類組成用SW表示。

圖8 沉積物及水體中綠藻微觀繁殖體的種類組成Fig.8 Species compositions of the micro-propagules in the sediment and water

沉積物及水體中有孔石莼(Ulva pertusa)、滸苔(Ulva prolifera)、緣管滸苔(Ulva linza)以及一種石莼屬的未知種(Ulvaspp.)[36]等大型綠藻的微觀繁殖體。檢測得出的綠藻微觀繁殖體種類組成與之前的調(diào)查中該海域大型海藻的種類組成相一致[25],也與現(xiàn)場調(diào)查中觀測到的大型海藻種類一致。秦皇島綠潮的主要致災(zāi)種滸苔微觀繁殖體在5月、6月和8月均有出現(xiàn),其中,在6月滸苔占比最高,達(dá)到40%;緣管滸苔僅在9月的沉積物中發(fā)現(xiàn),占比為20%;孔石莼在6月的沉積物中和水體中均有分布。

2.5 綠藻微觀繁殖體豐度與環(huán)境因子及大型海藻的關(guān)系

綠藻微觀繁殖體的豐度與可溶性無機(jī)氮(DIN)濃度、磷酸鹽(PO4-P)濃度、溶解氧(DO)質(zhì)量濃度、鹽度(S)、溫度(t)以及該海域懸浮海藻(suspended macroalgae,SMA)和定生海藻(attached macroalgae,AMA)的生物量之間的冗余分析(redundancy analysis,RDA)結(jié)果如圖9所示。水體中綠藻微觀繁殖體(micro-propagules in water,MW)豐度與懸浮海藻生物量、可溶性無機(jī)氮濃度呈正相關(guān)性,相關(guān)性較大;此外,其與溶解氧質(zhì)量濃度、定生海藻生物量、磷酸鹽濃度也呈正相關(guān)性,而與鹽度、溫度呈負(fù)相關(guān)性。沉積物中的微觀繁殖體(micro-propagules in sediment,MS)豐度與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系基本與水體中綠藻微觀繁殖體的相關(guān)關(guān)系一致,與可溶性無機(jī)氮濃度、定生海藻生物量及懸浮海藻生物量有較高的正相關(guān)性,但與磷酸鹽濃度的相關(guān)性較低。

圖9 綠藻微觀繁殖體豐度分布與環(huán)境因子的RDA分析Fig.9 The RDA analysis between environmental factors and the abundance of micro-propagules

3 討 論

3.1 綠藻微觀繁殖體的豐度分布及其影響因素

2020年5至9月,秦皇島金夢海灣海域的水體中存在少量的綠藻微觀繁殖體。其中,6月微觀繁殖體的總豐度最高,而7月和8月最低。這些微觀繁殖體主要分布在離岸較近的水體中,其豐度隨著離岸距離的增加而降低。

沉積物中存在著豐富的綠藻微觀繁殖體,在6月微觀繁殖體數(shù)量最多時,其豐度可以達(dá)到148株/g。但在7月,沉積物中的綠藻微觀繁殖體豐度為0,在8月和9月也只有少量的綠藻微觀繁殖體存在。在空間上,沉積物中的綠藻微觀繁殖體在不同采樣站位之間的分布與水體一致:近岸多、遠(yuǎn)岸少。除此之外,沉積物中的綠藻微觀繁殖體存在垂直分布特征,沉積物中的微觀繁殖體在垂直分布上呈現(xiàn)5 cm以淺豐度高、5 cm以深豐度低的特征,這與黃海沉積物中微觀繁殖體豐度的垂直分布特征[37]一致,原因可能是:石莼屬綠藻產(chǎn)生的孢子不具備孢囊,其對環(huán)境的耐受程度以及存活時間有限;該海域沉積物的沉積作用較強(qiáng),水體和沉積物交換比較頻繁。

水體和沉積物中的綠藻微觀繁殖體的時間和空間分布主要受到以下因素的影響:

1)依據(jù)微觀繁殖體豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系分析,秦皇島綠藻微觀繁殖體的分布與大型海藻的分布密切相關(guān)。在有懸浮大型海藻的近岸,水體和沉積物中的綠藻微觀繁殖體豐度均較高。這是因?yàn)榍鼗蕧u近岸海藻床的定生綠藻生長成熟后,脫離附著基懸浮生長。成熟綠藻釋放微觀繁殖體,釋放的微觀繁殖體由于運(yùn)動能力差通常聚集在源頭區(qū)域[38],即微觀繁殖體豐度隨離岸距離的增加而逐漸降低,原因是被海流輸送至外海的過程中,其豐度會因海水稀釋[22]。

2)在時間分布方面,懸浮海藻和定生海藻生物量的變化趨勢與水體和沉積物中綠藻微觀繁殖體豐度的變化趨勢總體一致,均在6月出現(xiàn)最高值而在7月出現(xiàn)低值。這可能是由該海域發(fā)生了異常風(fēng)暴潮天氣(2020年7月18日秦皇島發(fā)布了風(fēng)暴潮Ⅳ級警報)所致。風(fēng)暴潮引發(fā)的波浪會影響近岸生物群落的結(jié)構(gòu)、分布和生物量,尤其對潮間帶以及潮下帶的淺水區(qū)域中的生物群落[39]影響較大。而且,風(fēng)暴潮對大型海藻具有移除作用[40]。7月,近岸的懸浮海藻急劇減少,微觀繁殖體的釋放源頭被破壞,造成了微觀繁殖體豐度的顯著降低。

3)溫度、鹽度、溶解氧和營養(yǎng)鹽等環(huán)境要素也會影響水體中微觀繁殖體的豐度。當(dāng)溫度、鹽度、溶解氧和營養(yǎng)鹽均處于較高水平時,大型綠藻會持續(xù)釋放微觀繁殖體,水體和沉積物中的微觀繁殖體豐度都會增加[3,41-42]。調(diào)查期間,秦皇島金夢海灣海域的溫度和鹽度基本處于大型綠藻生長和微觀繁殖體釋放的適應(yīng)范圍內(nèi),但可能由于突發(fā)風(fēng)暴潮的影響,調(diào)查期間該海域的溫度和鹽度與綠藻微觀繁殖體的豐度均表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。

4)DIN和PO4-P是大型綠藻生長繁殖的重要營養(yǎng)物質(zhì)[43-44],其濃度和質(zhì)量濃度與微觀繁殖體豐度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。在調(diào)查期間,海域中豐富的DIN為大型綠藻的生長和微觀繁殖體的釋放提供了充足的氮源,使得綠藻微觀繁殖體在金夢海灣海域廣泛存在。

3.2 綠藻微觀繁殖體在綠潮暴發(fā)中的作用

調(diào)查中發(fā)現(xiàn):懸浮海藻釋放的微觀繁殖體廣泛分布在秦皇島金夢海灣海域的水體和沉積物中,在條件適宜時,這些微觀繁殖體可以附著在泥沙顆粒等基質(zhì)上萌發(fā)成幼苗,使綠藻的生物量在短時間內(nèi)大量增加[22]。

大型綠藻釋放的孢子由于不具有趨光性而更多地分布在沉積物中,孢子存活的時間比配子更長[45],在黑暗等不利條件下,水體中的綠藻微觀繁殖體減少時,沉積物中的孢子仍能萌發(fā),并在水體與沉積物交換時對水體中的微觀繁殖體進(jìn)行補(bǔ)充。

4 結(jié) 論

本文采用了現(xiàn)場調(diào)查與室內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,調(diào)查了秦皇島金夢海灣海域的綠藻微觀繁殖體,并分析了影響該豐度分布的因素,得出結(jié)論:2020年5月至9月,綠藻微觀繁殖體在秦皇島金夢海灣海域的水體和沉積物中廣泛存在。在時間上,微觀繁殖體豐度在6月豐度最高,在7月和8月豐度較低。在空間上,綠藻微觀繁殖體主要分布在金夢海灣近岸幼大型海藻分布的海域;在沉積物中微觀繁殖體存在垂直分布規(guī)律,主要分布在5 cm以淺的沉積物中。綠藻微觀繁殖體豐度的時空分布主要受到大型綠藻的影響,也受該海域溫度、鹽度、DIN、PO4-P等環(huán)境因子的影響。

秦皇島位于中緯度地區(qū),冬季氣溫低、持續(xù)時間長。大型綠藻往往通過釋放微觀繁殖體,形成“種子庫”來耐受冬季的惡劣條件[45-47],為第二年綠潮的暴發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,研究綠藻微觀繁殖體的時空分布特征及影響因素將有助于判別綠藻的來源,研究綠藻微觀繁殖體的越冬機(jī)制,以及為防治措施的制定等提供科學(xué)依據(jù)。