阿莫西林克拉維酸鉀復方制劑中克拉維酸鉀雜質分析

沈丹丹 沈川 程義 侯立新,*

(1 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質量監(jiān)測重點實驗室，重慶 401121；2 重慶綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401420)

阿莫西林/克拉維酸鉀組成的復方制劑最早由Beecham公司(現(xiàn)為葛蘭素史克公司)于1981年4月3日在英國上市，劑型為片劑，商品名Augmentin，規(guī)格為0.375 g(阿莫西林/克拉維酸：250 mg / 125 mg)。目前國內阿莫西林/克拉維酸鉀復方制劑獲批的劑型有7種，本次國家評價性抽樣品種包括片劑、分散片、顆粒劑及膠囊劑4種劑型，片劑、分散片與顆粒劑現(xiàn)行標準為《中國藥典》2020年版二部(ChP2020)[1-3]，膠囊劑現(xiàn)行標準為注冊標準[4]，國外藥典美國藥典(USP43)[5]及英國藥典(BP2021)[6]均收載了復方制劑的質量標準。按照法定標準檢驗，發(fā)現(xiàn)有關物質均未對克拉維酸鉀引入的雜質進行有效控制，不能反映產品中雜質的真實含量，存在一定的安全性風險。目前國外藥典均僅對復方制劑中阿莫西林引入的雜質進行了控制，相關文獻[7-8]也只研究了阿莫西林的雜質來源及歸屬問題，而復方制劑中克拉維酸鉀的雜質譜研究仍為空白。

本次評價的阿莫西林/克拉維酸鉀復方制劑共涉及3個組分比例(包括2:1、4:1、7:1)，存在規(guī)格多(共涉及9個規(guī)格)、主成分的量差異大的問題，因此可能存在主成分紫外吸收差異大的問題，特別是對于積分面積較小的主成分克拉維酸，其有關物質容易被忽視。本研究針對阿莫西林/克拉維酸鉀復方制劑中雜質控制不全面的問題，結合BP2021阿莫西林[9]和克拉維酸鉀[10]的雜質譜，建立能同時測定制劑中阿莫西林和克拉維酸鉀的有關物質HPLC檢查方法，重點分析克拉維酸鉀的雜質歸屬和降解途徑，對未開展本品一致性評價的企業(yè)提供處方工藝及質量研究基礎。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器

沃特世液相色譜系統(tǒng)：美國Waters e2695型高效液相色譜儀， Waters 2489型紫外檢測器，Waters色譜工作站。德國Bruker Impact Ⅱ液相色譜/質譜聯(lián)用儀。Mettler Toledo XP 205十萬分之一電子天平。

1.2 藥品與試劑

阿莫西林雜質A～雜質M對照品、N-新戊酰阿莫西林對照品均來源于Toronto Research Chemicals；克拉維酸雜質A對照品(Toronto Research Chemicals，批號：P840815，含量：98%)；克拉維酸雜質B對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221202，含量：99.77%)；克拉維酸雜質C對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221203，含量：97.96%)；克拉維酸雜質D對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221204，含量：95.49%)；克拉維酸雜質G對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221207，含量：98.28%)；來自國內3個生產企業(yè)的11批克拉維酸鉀-微晶纖維素混粉(1:1)、2個生產企業(yè)的9批阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1、4:1、7:1)、4個生產企業(yè)的12批阿莫西林原料及23個生產企業(yè)的226批制劑均為2020年度國家評價性抽驗樣品；1批阿莫西林克拉維酸鉀片參比制劑[Glaxo Smith Kline，規(guī)格為0.375 g(阿莫西林/克拉維酸：250 mg/125 mg)，批號860950]；磷酸二氫鈉及磷酸均為分析純，甲醇為色譜純。

2 方法

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(YMC ODSAQ C18，4.6 mm×250 mm，5 μm )；以緩沖液[取磷酸二氫鈉7.8 g，加水1000 mL使溶解后，用磷酸調節(jié)pH值至(3.7±0.1)]為流動相A，以甲醇-緩沖液(90:10,V/V)為流動相B，按表1梯度洗脫；柱溫35℃；自動進樣器6 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為220和275 nm；進樣體積20 μL。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗溶液(1)

取阿莫西林雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質G、雜質H、雜質I、雜質K、雜質L、N-新戊酰阿莫西林對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，加水適量超聲使溶解后(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，用水定量稀釋制成含各雜質約0.1 mg/mL的溶液，作為雜質對照品貯備溶液(1)；阿莫西林雜質F適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解后，用水定量稀釋制成含雜質F約0.1 mg/mL的溶液，作為雜質對照品貯備溶液(2)；另取克拉維酸對照品、克拉維酸雜質D、克拉維酸雜質G對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中各約含0.1 mg的溶液，作為雜質對照品貯備溶液(3)。取阿莫西林雜質J對照品約7.5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，精密加入上述雜質對照品貯備溶液(1)、(2)及(3)各0.4 mL，加水適量超聲使溶解，保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃，并用水稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液(1)。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗溶液(2)

取克拉維酸雜質A、雜質B及雜質C對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中各約含0.1 mg的溶液。精密量取0.5 mL，置20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液(2)。

2.2.3 供試品溶液

取本品的細粉或內容物適量(約相當于阿莫西林75 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%，超聲使溶解后(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，用水稀釋至刻度，搖勻，離心取上清液。臨用新配。

2.2.4 對照品溶液

取阿莫西林及克拉維酸對照品各適量，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林約0.017 mg、克拉維酸約0.005 mg的溶液。此溶液可在6℃保持穩(wěn)定20 h。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”及“2.2.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

2.4 降解試驗

經調研各企業(yè)處方工藝，目前國內原料投料主要以克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)和阿莫西林克拉維酸鉀混粉2種方式，故本文中降解試驗重點考察了克拉維酸鉀的雜質降解途徑。

(1)未降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(2)強酸降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，加入0.2 mol/L鹽酸溶液1.0 mL，搖勻，放置10 min，加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(3)強堿降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，在50℃水浴加熱1 h，冷卻至室溫，用0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(4)強氧化降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，加入1%過氧化氫溶液1.0 mL，放置10 min，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(5)高溫降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，置烘箱中105℃條件下加熱1 h，取出冷卻至室溫，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(6)強光降解試驗：取在4000 Lx下光照5 d的克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

2.5 影響因素試驗

(1)高溫試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，40℃條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(2)高濕試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，在溫度20℃、相對濕度(70%±5%)條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(3)光照試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，在(4500±500) Lx下光照5和10 d，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

3 結果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

檢測波長220 nm下，系統(tǒng)適用性溶液(1)的色譜圖見圖1(A)，結果見表2，阿莫西林雜質D1與阿莫西林雜質B的分離度大于1.5，阿莫西林雜質E1與克拉維酸雜質G的分離度大于1.0；檢測波長275 nm下，系統(tǒng)適用性溶液(2)的色譜圖見圖1(B)，結果見表3，色譜峰出峰順序為：克拉維酸雜質A、克拉維酸雜質B、克拉維酸雜質C。

表2 系統(tǒng)適用性溶液(1)測定結果(220 nm)Tab.2 The results of system suitability solution (1)(220 nm)

表3 系統(tǒng)適用性溶液(2)測定結果(275 nm)Tab.3 The results of system suitability solution (2)(275 nm)

3.2 克拉維酸鉀雜質譜的分析

3.2.1 降解試驗

降解試驗結果(表4～5)表明，克拉維酸鉀對酸、堿、氧化均不穩(wěn)定，堿性條件主要降解產生雜質A、雜質B、雜質C與雜質D，酸性條件和氧化條件主要產生其他未知雜質；阿莫西林對酸、堿及氧化均不穩(wěn)定，主要降解產生雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質J、雜質K。降解試驗典型色譜圖見圖2。

表4 克拉維酸鉀的雜質譜分析(220 nm)Tab.4 The results of the impurity profile of potassium clavulanate(220 nm)

3.2.2 影響因素試驗

結果表明，在高溫和高濕條件下，參比制劑與國內仿制產品的阿莫西林和克拉維酸鉀均不穩(wěn)定，特別是高濕條件，典型色譜圖見圖3，克拉維酸鉀非常容易降解。在220 nm下，主要檢出阿莫西林的降解雜質為阿莫西林雜質C、雜質D、雜質E、雜質F和雜質K；在275 nm下，主要檢出克拉維酸鉀的降解雜質為克拉維酸鉀雜質A、雜質B和雜質C。

3.3 水活度與克拉維酸鉀雜質的相關性研究

采用冷鏡露點法測定樣品水活度，水活度反應了制劑中含自由水的量度值。不同企業(yè)水活度測定值與克拉維酸鉀的雜質測定結果見圖4～7。結果表明，克拉維酸鉀雜質的含量與水活度值大小呈正相關，證明水分含量中的自由水是直接影響產品穩(wěn)定性的關鍵指標。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

本研究對檢測波長進行了考察，采用PDA全波長190～400 nm掃描雜質對照品，結果表明：(1)阿莫西林及阿莫西林雜質均在190～300 nm范圍內有一定吸收；(2)克拉維酸鉀、克拉維酸鉀雜質D及克拉維酸鉀G均在190～240 nm范圍內有一定吸收，且克拉維酸鉀在240 nm后基本沒有吸收；(3)克拉維酸鉀雜質A、克拉維酸鉀雜質B及克拉維酸鉀雜質C均在210和275 nm處有最大吸收，在220～250 nm吸收很弱；(4)綜合各雜質的紫外吸收差異，確定以雙波長測定阿莫西林克拉維酸鉀雜質，以220 nm檢測波長測定阿莫西林雜質及克拉維酸鉀雜質D、克拉維酸鉀雜質G，以275 nm檢測波長測定克拉維酸鉀雜質A、克拉維酸鉀雜質B、克拉維酸鉀雜質C，從而達到一個色譜系統(tǒng)同時測定與控制兩個主成分的雜質。

表5 克拉維酸鉀的雜質譜分析(275 nm)Tab.5 The results of the impurity profile of potassium clavulanate(275 nm)

4.2 色譜條件的比對

國內外藥典僅ChP2020與BP2021復方制劑質量標準中收載了有關物質檢測項目，均采用梯度洗脫(梯度時間均約為60 min)，但流動相組成及檢測波長均不相同(ChP2020為230 nm，BP2021為254 nm)，說明國內外藥典色譜條件均不能有效控制在220～250 nm吸收很弱的克拉維酸鉀雜質A、雜質B及雜質C，存在一定安全性風險的問題。因此，本研究建立了以雙波長測定紫外吸收差異較大的各雜質含量，主要優(yōu)勢為：①能同時測定阿莫西林與克拉維酸鉀的工藝雜質和降解雜質；②各雜質分離度更好；③測定的雜質個數(shù)及雜質總量更高，更能真實反映產品雜質水平。

4.3 克拉維酸鉀雜質降解途徑

通過對企業(yè)調研，發(fā)現(xiàn)目前克拉維酸鉀合成工藝主要有兩種，一種以發(fā)酵液中的鏈霉菌棒狀體通過發(fā)酵合成克拉維酸叔丁胺，另一種直接以克拉維酸叔丁胺為起始物料。當克拉維酸鉀的β-內酰胺環(huán)與水或其他親核基團反應時，酰胺鍵的水解可能導致β-內酰胺環(huán)的開環(huán)，β-內酰胺基水解后可能發(fā)生一系列反應。降解試驗及影響因素結果表明：在酸性條件下，克拉維酸鉀主要在220 nm下降解產生未知雜質，主要未知雜質RRT分別為0.28、0.63和1.09；在堿性條件下，在220 nm下產生克拉維酸鉀雜質D，在275 nm主要下產生克拉維酸鉀雜質A、克拉維酸鉀雜質B和克拉維酸鉀雜質C；在氧化條件下，主要在220 nm下降解產生未知雜質；高溫及高濕條件下，主要降解產生克拉維酸鉀雜質A、雜質B和雜質C。結合克拉維酸鉀的合成工藝，本研究推測了克拉維酸鉀的雜質譜，即克拉維酸鉀雜質G是路線一的發(fā)酵副產物，并非降解雜質，而雜質A、雜質B、雜質C和雜質D為主要降解雜質。

4.4 水活度與雜質的相關性

克拉維酸鉀雜質的含量與水活度值大小呈正相關，說明本品對高濕極為敏感，提示國內生產企業(yè)在生產過程中應嚴格控制環(huán)境濕度，選擇密封性好、防潮功能強的包裝材料，以避免在生產、貯存過程中吸收水，或者避免水活度在不同成分或者包裝系統(tǒng)中遷移，以保證產品的持續(xù)穩(wěn)定性。ChP2020規(guī)定本品均應在涼暗處干燥保存(遮光并不超過20℃)，原研制劑說明書中規(guī)定在25℃以下的溫度下存放，并存放在原始包裝中以防潮，因此建議國內說明書應考慮到開封后的防潮能力和產品質量，以保證產品的安全性。

4.5 小結

目前國內外藥典收載的阿莫西林克拉維酸鉀復方制劑質量標準均缺失克拉維酸鉀雜質的有效控制方法，而本品存在穩(wěn)定性差、極容易降解產生雜質的問題，現(xiàn)行標準不能滿足本品的有關物質檢查，導致產品質量不可控，容易引起安全性風險。本研究建立了以雙波長同時測定阿莫西林及克拉維酸鉀雜質的HPLC方法，該方法靈敏度高，分離效果好，能同時測定兩個活性成分的工藝雜質和降解雜質，并且能對兩個活性成分引入的雜質分別進行歸屬與控制。本研究中克拉維酸鉀在酸性及氧化條件下產生的較大未知雜質還有待進一步研究。