癌細(xì)胞膜靶向相變納米分子探針研制及光聲/超聲雙模態(tài)顯像與光熱治療乳腺癌

唐芮，胡雅琴，何紅葉，林曉紅，萬莉，李攀*

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.重慶市人民醫(yī)院超聲科，重慶 401121；*通信作者 李攀 lipan@hospital.cqmu.edu.cn

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]，早期診斷和精準(zhǔn)治療是降低其死亡率的關(guān)鍵[2]。分子成像技術(shù)是實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)診療的重要途徑，超聲分子成像近年發(fā)展迅速，具有無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動態(tài)、分辨率高等獨(dú)特優(yōu)勢[3]。光聲（photoacoustic，PA）成像是基于超聲成像發(fā)展起來的一種無創(chuàng)、低成本新型生物醫(yī)學(xué)成像方法，可以提供高分辨率和高對比度的活體組織成像[4]。基于分子探針的應(yīng)用可同時(shí)整合光聲/超聲雙模態(tài)成像，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，為乳腺癌的早期精準(zhǔn)診療提供新方法。然而，目前常用的外源性分子探針易被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，半衰期短，靶向效果不佳。近年研究表明，采用癌細(xì)胞膜對分子探針進(jìn)行修飾后，可延長其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，更重要的是，癌細(xì)胞膜上特定的蛋白質(zhì)分子可使分子探針靶向同源性腫瘤[5]。本研究擬制備一種癌細(xì)胞膜包被的相變納米分子探針，用于光聲/超聲雙模態(tài)分子顯像，并探討其對乳腺癌的同源靶向能力及光熱治療（photothermal therapy，PTT）殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 羧基端聚乳酸/羥基乙酸[（polylactic acid-glycolic acid copolyme，PLGA）PLGACOOH，濟(jì)南岱罡]、磁性四氧化三鐵Fe3O4納米顆粒（Ocean Nano Tech）、全氟戊烷[（perfluoropentane，PFP），Elf Atochem]、聚乙烯醇[（polyvinylalcohol，PVA），Sigma]、DiI染料（上海碧云天），鈣黃綠素AM/PI檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒（碧云天），甲基磺酰氟（MSF，碧云天），RPMI1640完全培養(yǎng)基（上海中喬新舟生物科技有限公司），胰蛋白酶（碧云天生物有限公司），乳腺癌4T1、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞與黑色素瘤B16F10細(xì)胞（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所）。

聲振儀（Sonic）、脂質(zhì)體擠出器（Avestin，Canada）、激光粒徑儀（Malvern）、激光共聚焦顯微鏡（Nikon）、Hitachis-3400N電子顯微鏡、DFY型超聲圖像定量分析診斷儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）、Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）、808 nm激光儀（FC808-2W-MM西安中川光電科技）、熱紅外成像儀（美國Fotric公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備納米分子探針 ①相變納米分子探針PFPNPs制備：采用雙乳化法制備PFP-NPs，稱取50 mg PLGA，與50 μl Fe3O4溶于2 ml二氯甲烷中，完全溶解后加入200 μl PFP；在冰浴條件下聲振（40 W，3 min）；加入8 ml PVA，再次聲振3 min；加入10 ml異丙醇，磁力攪拌2～3 h；低溫離心（10 000 r/min，8 min）、雙蒸水洗滌后得到納米探針。另制備不含PFP的Fe3O4-PLGA-NPs。②癌細(xì)胞膜（cancer cell membrane，CCM）提?。菏占瘜?shù)生長期4T1細(xì)胞懸液，以4℃、3 000 r/min、5 min條件離心，去上清，加入含有膜蛋白提取劑和PMSF的低滲裂解緩沖液，冰浴15 min；反復(fù)凍融3次，4℃、700 g離心10 min，取上清；14 000 g離心30 min，取沉淀，即得CCM，凍干備用。③CPFP-NPs制備：參照相關(guān)文獻(xiàn)制備靶向納米探針CPFP-NPs[6-7]，將上述制備的PFP-NPs與CCM按一定比例混合，通過400 nm聚碳酸酯膜將混合液來回?cái)D壓得到CPFP-NPs分子探針，另采用同樣方法制備CCM-Fe3O4-PLGA-NPs（CFPNPs），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分子探針表征 所制備的CFP-NPs分子探針混懸液呈淺棕色，激光共聚焦顯微鏡下觀察DiI紅色熒光標(biāo)記的分子探針的形狀，透射電鏡觀察分子探針的結(jié)構(gòu)，Malvern激光粒徑儀檢測分子探針包膜前后的粒徑及表面電位。ICP-OES法測定分子探針Fe3O4含量，計(jì)算其包封率和載藥率。SDS-PAGE檢測膜蛋白含量，驗(yàn)證癌細(xì)胞膜包被效果。

1.2.3 CPFP-NPs同源靶向能力 常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌4T1、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞與黑色素瘤B16F10細(xì)胞。取對數(shù)生長期4T1細(xì)胞以1×106個(gè)/皿接種于共聚焦培養(yǎng)皿中孵育過夜，分別與DiI標(biāo)記的CPFP-NPs及PFP-NPs（濃度均為5 mg/ml、100 μl）共培養(yǎng)0.5、1、2、4 h；另取對數(shù)生長期MDA-MB-231、MCF-7和B16F10細(xì)胞，同上分別與CPFP-NPs（5 mg/ml、100 μl）共同孵育4 h。孵育結(jié)束后，經(jīng)PBS漂洗并以多聚甲醛固定細(xì)胞，再加入DAPI 200 μl染色，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察納米探針靶向結(jié)合細(xì)胞情況。

1.2.4 CPFP-NPs分子探針體外光聲/超聲成像 取不同濃度CPFP-NPs（1、2、3、4、5 mg/ml）200 μl，加入3%瓊脂糖凝膠孔模型中，經(jīng)光聲成像儀激光（690 nm）觸發(fā)后，采集光聲信號。取1 mg/ml CPFP-NPs滴于載玻片上，置于加熱板上，光鏡下觀察不同溫度下（25℃、40℃、45℃、50℃）分子探針相變情況。將CPFP-NPs（2.5 mg/ml、5 mg/ml）、CFP-NPs（5 mg/ml）及PBS分別加入瓊脂糖凝膠孔模型中，在808 nm處以近紅外激光儀輻照（2 W/cm2、5 min），然后觀察各組超聲成像情況，并用DFY軟件定量分析造影增強(qiáng)信號。

1.2.5 CPFP-NPs分子探針光熱性能評估 將不同濃度（1.25、2.5、5、10 mg/ml）的CPFP-NPs分子探針置于96孔板中，用808 nm激光輻照（2 W/cm2、10 min）；另將濃度為10 mg/ml的CPFP-NPs分子探針置于96孔板中，以不同功率激光（0.5、1.0、2.0、2.5 W/cm2）輻照10 min；將濃度為10 mg/ml的CPFP-NPs分子探針置于96孔板中，808 nm激光儀輻照10 min（2 W/cm2），關(guān)閉激光，室溫自然冷卻，重復(fù)6次；經(jīng)熱紅外成像儀實(shí)時(shí)監(jiān)測孔板中的溫度變化。

1.2.6 分子探針體外PTT效果觀察 取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，以1×106個(gè)/皿接種于共聚焦培養(yǎng)皿中孵育過夜，分為CPFP-NPs+激光組、不含PFP的CFP-NPs+激光組、不包膜的PFP-NPs+激光組、單純CPFP-NPs組、單純激光組和PBS組。將各組分子探針（5 mg/ml、100 μl）分別與細(xì)胞共孵育4 h，聯(lián)合Laser組在孵育后給予808 nm激光儀輻照（2 W/cm2、10 min），繼續(xù)孵育1 h。采用AM/PI活死細(xì)胞染料避光染色20 min，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照；Annexin V-FITC/PI熒光染色，離心重懸，細(xì)胞流式分析儀定量分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism v8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-最小顯著差異t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示；使用線性回歸比較分子探針濃度增加對光聲信號的影響；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPFP-NPs分子探針的表征 成功制備了4T1細(xì)胞包被的同時(shí)攜載PFP和Fe3O4的相變納米分子探針CPFPNPs，在光鏡及電鏡下觀察，分散均一（圖1A），呈核殼結(jié)構(gòu)（圖1B），經(jīng)癌細(xì)胞膜包被后，納米粒平均粒徑由（210.47±1.11）nm增加為（237.17±2.60）nm（圖1C），表面電位由（-10.22±1.32）mV變?yōu)椋?19.50 ±0.27）mV（圖1D）；ICP-OES測定后計(jì)算得Fe3O4的包封率為96.64%，載藥率為29.31%；SDS-PAGE結(jié)果顯示CPFPNPs和CCM、4T1細(xì)胞具有相似的蛋白條帶（圖1E）。

2.2 CPFP-NPs分子探針的同源靶向能力 將CPFPNPs和PFP-NPs分子探針分別與4T1腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)0.5、1、2、4 h，共聚焦顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)可見紅色熒光的分子探針，且隨孵育時(shí)間延長而增多，且CPFP-NPs組紅色熒光最強(qiáng)，4 h時(shí)達(dá)峰，靶向結(jié)合率為92.01%（圖2A）。MDA-MB-231、MCF-7和B16F10組細(xì)胞周圍聚集的分子探針較少，靶向結(jié)合率分別為37.87%、38.55%、34.17%（圖2B、C）。

2.3 CPFP-NPs分子探針體外光聲/超聲雙模成像CPFP-NPs分子探針在光聲成像儀激光的照射下顯示出良好的光聲信號（紅色），隨著分子探針濃度增加，光聲信號也呈線性增強(qiáng)（圖3A）。光鏡觀察下，25℃時(shí)未見明顯相變，40℃時(shí)可觀察到少數(shù)相變形成的微氣泡，當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，可見大量微氣泡，50℃時(shí)微氣泡變大并開始破裂（圖3B）。808 nm激光輻照后，在二維超聲及造影模式下，高濃度CPFP-NPs組（5 mg/ml）超聲信號明顯強(qiáng)于低濃度組（2.5 mg/ml），不含PFP的CFP-NPs組僅有少許點(diǎn)狀超聲信號，PBS組無超聲增強(qiáng)信號（圖3C、D），與PBS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 CPFP-NPs分子探針體外光熱轉(zhuǎn)換性能及光熱穩(wěn)定性評估 在808 nm激光輻照下，隨CPFP-NPs分子探針濃度、輻照功率增加，溫度逐漸升高，光熱效應(yīng)呈濃度及功率依賴性（圖4A～D）。在808 nm激光連續(xù)6個(gè)循環(huán)開-關(guān)中，CPFP-NPs保持了較穩(wěn)定的光熱升溫效應(yīng)（圖4E）。

2.5 CPFP-NPs分子探針體外PTT 通過鈣黃綠素AM/PI染色觀察細(xì)胞存活情況，活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。與PBS組比較，單純CPFP-NPs組和單純激光組的視野中細(xì)胞存活率無明顯變化，未見明顯紅色熒光；PFP-NPs+激光組細(xì)胞存活率略有下降，可見少許紅色熒光；而CFP-NPs+激光與CPFP-NPs+激光組細(xì)胞存活率明顯下降，可見明顯紅色熒光，CPFPNPs+激光組細(xì)胞存活率下降最明顯，見大量死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光（圖5A）。流式細(xì)胞儀定量分析也顯示相同的趨勢，CPFP-NPs+激光組PTT效果最佳，細(xì)胞凋亡率為95.97%，而PBS組及其他實(shí)驗(yàn)組分別為10.29%、12.79%、13.93%、49.13%、89.34%（圖5B、C）。

3 討論

3.1 分子探針研究進(jìn)展 分子成像技術(shù)具有實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、動態(tài)、分辨率高等優(yōu)勢，為乳腺癌早期精準(zhǔn)診療提供了一種新方法[8-9]。目前常見的分子探針主要采用外源性的小分子有機(jī)染料、金屬納米顆粒、碳納米材料及有機(jī)納米多聚物等，因體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，分子探針在腫瘤局部蓄積較少，嚴(yán)重限制了其靶向顯像與治療效果[10-11]。癌細(xì)胞膜包被和修飾的新型內(nèi)源性分子探針，不僅具有高生物相容性和較長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，而且對同源腫瘤具有主動靶向能力[12-14]。

3.2 仿生納米探針同源靶向能力 本研究制備了同時(shí)攜載PFP和Fe3O4的PLGA相變納米分子探針（CPFP-NPs），經(jīng)乳腺癌4T1細(xì)胞膜包被后，其粒徑電位的改變與SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果均顯示，分子探針攜載完整的癌細(xì)胞膜蛋白成分，證實(shí)包被成功。將CPFP-NPs及未包膜的納米粒（PFP-NPs）分別與4T1細(xì)胞共同孵育后，細(xì)胞對CPFP-NPs的吞噬率（92.01%）顯著高于PFP-NPs，表明CPFP-NPs具有較好的同源靶向性。

3.3 仿生納米探針PA/US雙模態(tài)成像 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4納米顆粒有良好的光聲成像能力[15-16]，本研究中CPFP-NPs攜載Fe3O4后，在690 nm處也顯示出較好的光聲成像效果，且隨納米探針濃度升高，光聲信號逐漸增強(qiáng)。此外，PFP是一種低沸點(diǎn)氟碳材料（29℃），在外界壓力增加或溫度升高時(shí)可由液態(tài)變?yōu)闅鈶B(tài)[17]。將PFP載入納米分子探針CPFP-NPs后，在體外保持了較好的穩(wěn)定性，在25℃、40℃時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯液-氣相變情況，只有當(dāng)溫度上升45℃時(shí)，才觀察到大量相變微氣泡產(chǎn)生，與既往研究結(jié)果一致[18]。同時(shí)，經(jīng)激光輻照（2 W、5 min）后，CPFP-NPs產(chǎn)生明顯的增強(qiáng)超聲顯像效果，其機(jī)制可能為Fe3O4作為良好的光熱材料可將光能轉(zhuǎn)化為熱能，當(dāng)溫度達(dá)到PFP沸點(diǎn)時(shí)觸發(fā)相變，從而實(shí)現(xiàn)了超聲增強(qiáng)成像。因此，CPFPNPs可以作為一種穩(wěn)定的相變分子探針，實(shí)現(xiàn)光聲/超聲雙模態(tài)成像，為PTT提供影像引導(dǎo)。

3.4 仿生納米探針光熱治療效果 PTT是利用具有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料在近紅外激光的照射下，將光能轉(zhuǎn)換為熱能，使腫瘤組織迅速升溫誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[19-20]。Fe3O4因性質(zhì)穩(wěn)定、光熱轉(zhuǎn)換效率高、毒性低而備受關(guān)注。本研究中CPFP-NPs分子探針（5 mg/ml），在2 W、10 min的輻照條件下，溫度迅速上升，顯示出良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，因此可以作為一種優(yōu)良的光熱診療劑。溫度上升至50℃時(shí)，部分微氣泡發(fā)生破裂產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)，可以進(jìn)一步協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞。鈣黃綠素AM/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果亦證實(shí)，CPFP-NPs聯(lián)合激光對腫瘤細(xì)胞具有最強(qiáng)殺傷效果，細(xì)胞凋亡率高達(dá)95.97%。然而，本研究僅在細(xì)胞水平證實(shí)了CPFPNPs對乳腺癌細(xì)胞的靶向與殺傷能力，其體內(nèi)治療效果、分布以及生物安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證；PTT和PFP超聲空化協(xié)同殺傷腫瘤的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究成功制備了癌細(xì)胞膜包被的載PFP和Fe3O4的內(nèi)源性相變納米分子探針，可靶向識別腫瘤細(xì)胞，并具有良好的PA/US雙模態(tài)成像能力與PTT治療效果，在乳腺癌精準(zhǔn)治療中有潛在的應(yīng)用前景。