骨髓間充質干細胞移植聯(lián)合多點微量注射曲安奈德對兔耳增生性瘢痕及創(chuàng)面巨噬細胞極化的影響

左 楠，王 遠，王 爽

(1.西北大學附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院,陜西 西安 710018;2.西安市第五醫(yī)院,陜西 西安 710008;3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 710004)

瘢痕是各種創(chuàng)傷后所引起的正常皮膚組織的外觀形態(tài)和組織病理學改變的統(tǒng)稱，它是人體創(chuàng)傷修復過程中必然的產(chǎn)物，其不僅會影響患者美觀，而且部分生長到一定限度的瘢痕會引起諸如瘙癢、潰爛以及疼痛等嚴重影響患者生活質量[1-2]。增生性瘢痕是目前最常見的瘢痕類型之一，是一種在創(chuàng)面愈合的原始位置出現(xiàn)紅色和突起的瘢痕，其特征是過度纖維化和細胞外基質沉積[3]，其發(fā)病機制尚不清楚。目前國內(nèi)外治療瘢痕的方法在臨床上都不是很成熟，療效有待觀察，并且有的所需時間長、痛苦大、容易反復、出現(xiàn)不良反應等，許多都不盡如人意[4]。因此，開發(fā)增生瘢痕治療新療法意義重大。曲安奈德是一種皮質類固醇藥物，在臨床上主要被用于治療各類皮膚病或減少口腔潰瘍帶來的不舒適感[5-6]。 研究[7]表明，曲安奈德聯(lián)合其他療法對瘢痕具有一定的治療療效。目前，間充質干細胞因其治療和預防增生性瘢痕形成潛力而進入公眾視野。許多臨床試驗和臨床前試驗均表明，骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)[8]、絨毛膜間充質干細胞[9]、脂肪來源的間充質干細胞[10]等都具有促進皮膚傷口無瘢痕愈合和抑制組織纖維化的能力。然而，目前尚無BMSCs聯(lián)合曲安奈德治療瘢痕的研究報道，故本研究以兔耳創(chuàng)面模型為研究對象，使用BMSCs聯(lián)合曲安奈德瘢痕內(nèi)注射進行治療，探討B(tài)MSCs聯(lián)合曲安奈德對兔耳增生性瘢痕形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只新西蘭兔(2～2.5 kg，1～1.5歲，雄性)，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司，均為健康級。所有兔子均飼養(yǎng)在通風干燥處，單籠喂養(yǎng)1周后方可用于實驗研究。本研究所涉及動物研究均經(jīng)本院動物倫理委員會審查和監(jiān)督，符合美國國立衛(wèi)生院實驗動物護理和使用指南。

1.2 主要試劑與儀器 兔BMSCs(TOPCP0004，深圳市拓普生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(111995123,Gbico)，胎牛血清(10099141C，Gbico),組織RNA提取試劑盒(R6688-01，武漢普蘭德生物技術有限公司)，逆轉錄試劑盒/反轉錄試劑盒(AORT-0020，廣州天駿生物科技有限公司)，2×SYBR Green qPCR Master Mix(K1070，APExBIO)，曲安奈德注射液(國藥準字H53021605，昆明積大制藥股份有限公司)，4 mm 皮膚活檢穿孔器(15110-40，PELCO，美國)。

1.3 兔耳瘢痕模型的制作與分組 所有兔子術前禁食，耳靜脈注射3%的戊巴比妥鈉麻醉兔子，待兔子進入深度麻醉狀態(tài)后，使用4 mm 皮膚活檢穿孔器(15110-40，PELCO)。在每只耳朵的腹側建立1 cm×1 cm創(chuàng)面。隨機將60只兔子分為模型組、曲安奈德組和聯(lián)合治療組，每組20只。在制作創(chuàng)面3周后，模型組兔子不接受任何治療；曲安奈德組兔子創(chuàng)面瘢痕內(nèi)多點注射曲安奈德組，共計100 μl，每周治療2次，共計治療4周；聯(lián)合治療組兔子在曲安奈德組治療的基礎上，額外增加創(chuàng)面瘢痕內(nèi)注射BMSCs治療，共計0.5×106個BMSCs/只，每周治療2次，共計治療4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 創(chuàng)面愈合和完全上皮化時間：自實驗兔耳創(chuàng)面建立后，每日觀察創(chuàng)面愈合和創(chuàng)面上皮化情況，記錄創(chuàng)面愈合和完全上皮化時間。

1.4.2 瘢痕面積、突出高度和瘢痕指數(shù)：創(chuàng)面建立第42天，首先測量兔耳瘢痕面積，然后測量兔耳瘢痕最高點與周圍皮膚的落差(瘢痕突出高度)。最后，測量兔耳瘢痕最高點耳軟骨表面的垂直距離(A)，和瘢痕周圍正常組織到耳軟骨表面的垂直距離(B)，計算瘢痕指數(shù)(瘢痕指數(shù)=A/B)，瘢痕指數(shù)越高表明瘢痕增生越明顯。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測：耳靜脈注射3%的戊巴比妥鈉麻醉兔子，待兔子進入深度麻醉狀態(tài)后，取下兔瘢痕組織，加入液氮后碾磨成粉，使用組織RNA提取試劑盒提起組織總RNA，然后用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA。PCR參數(shù)設定：37 ℃、60 min，85 ℃、5 s。RT-qPCR：按照2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl 實時熒光定量PCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進行擴增。PCR引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結 果

2.1 一般情況 本研究建立的所有兔耳創(chuàng)面在術后10～15 d完成創(chuàng)面上皮化，所有創(chuàng)面都未見感染和穿孔等。三組兔創(chuàng)面均出現(xiàn)瘢痕，其中模型組兔創(chuàng)面瘢痕最明顯，瘢痕表現(xiàn)為紅色、質地較硬，并且瘢痕厚度明顯高于周圍組織且創(chuàng)面中心組織厚度最高；曲安奈德組兔創(chuàng)面瘢痕顏色為紅色，但色值較模型組淡、質地較軟、瘢痕厚度低于模型組，同樣表現(xiàn)為創(chuàng)面中心組織厚度高于周邊；聯(lián)合治療組兔創(chuàng)面瘢痕為淺紅色、質地在三組中最軟、表面平，創(chuàng)面瘢痕組織厚度高于周圍組織。

2.2 三組創(chuàng)面愈合和完全上皮化時間、瘢痕面積和突出高度比較 見表2。曲安奈德組兔耳創(chuàng)面完全上皮化時間、瘢痕面積和突出高度均顯著低于模型組兔，而聯(lián)合治療組以上指標比曲安奈德組更低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表2 三組兔耳創(chuàng)面愈合和完全上皮時間、瘢痕面積和突出高度比較

2.3 三組瘢痕指數(shù)比較 見表3。從第28天開始，曲安奈德組兔耳創(chuàng)面瘢痕指數(shù)均顯著低于模型組，而聯(lián)合治療組兔耳創(chuàng)面瘢痕指數(shù)均顯著低于曲安奈德組兔，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表3 三組兔耳創(chuàng)面瘢痕指數(shù)比較

2.4 三組創(chuàng)面瘢痕炎癥因子mRNA表達水平比較 見圖1。曲安奈德組兔耳創(chuàng)面炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1)表達水平均顯著低于模型組，而聯(lián)合治療組兔耳創(chuàng)面炎癥因子表達水平顯著低于曲安奈德組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

注：與模型組相比，#P<0.01；與曲安奈德組相比，*P<0.01

2.5 三組創(chuàng)面瘢痕巨噬細胞標志物表達水平比較 見圖2。曲安奈德組兔耳創(chuàng)面M1巨噬細胞標志物(CD16和iNOS)表達水平均顯著低于模型組，并且聯(lián)合治療組兔耳創(chuàng)面M1巨噬細胞標志物表達水平均顯著低于曲安奈德組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。曲安奈德組兔耳創(chuàng)面M2巨噬細胞標志物(CD206和Arg1)表達水平均顯著高于模型組，并且聯(lián)合治療組兔耳創(chuàng)面M2巨噬細胞標志物表達水平均顯著高于曲安奈德組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

注：與模型組相比，#P<0.01；與曲安奈德組相比，*P<0.01

3 討 論

目前國內(nèi)外治療瘢痕療法包括局部藥物封閉、皮膚移植、手術切除植皮、晶體磨瘢術、氣囊擴張術、抗體注射、放射治療、壓迫療法、激素療法以及硅酮類等療法。然而，無論那種瘢痕療法在臨床上都還不成熟，而且臨床療效尚需進一步觀察[4]。此外，由于瘢痕發(fā)生的機制目前尚不明確，所以目前瘢痕修復治療尚處于探索階段。對于傷口愈合機制的探討將有助于了解瘢痕形成的可能原因。之前的研究[11-12]表明，盡管傷口愈合的潛在機制很復雜，但炎癥是決定性因素之一。增生性瘢痕是由傷口異常愈合引起的病理性瘢痕，其主要特征是持續(xù)的局部炎癥和過多的膠原蛋白沉積[11-12]。因此，多種抗炎類藥物被用于預防和修復增生性瘢痕。

曲安奈德是一種皮質類固醇藥物，在多種疾病中具有顯著的抗炎作用，在之前的研究中被用于輔助藥物治療和預防增生性瘢痕[13-14]。本文研究發(fā)現(xiàn)，曲安奈德瘢痕內(nèi)多點微量注射有助于抑制增生性瘢痕的形成，而且BMSCs聯(lián)合曲安奈德對增生性瘢痕形成的抑制作用優(yōu)于單獨使用曲安奈德。間充質干細胞是一類多功能細胞，多存在于結締組織和器官組織的間質中，骨髓中含有豐富的間充質干細胞，被成為BMSCs。BMSCs具有較強的自我復制能力，在特定的部位植入BMSCs可以發(fā)揮促進組織修復、免疫調節(jié)以及炎癥抑制的功能，且由于BMSCs不具有倫理爭議，所以日益受到臨床治療的關注[15-16]。Xie等[17]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以顯著抑制降低兔耳創(chuàng)面的愈合時間以及瘢痕面積和突出高度。本次研究結果提示，BMSCs聯(lián)合曲安奈德預防增生性瘢痕的形成是有效的，而且聯(lián)合治療對增生性瘢痕形成的抑制作用明顯強于單獨使用曲安奈德。

盡管目前增生性瘢痕形成的具體分子機制尚未被揭示，但之前的研究表明炎癥通過調節(jié)傷口處膠原蛋白的合成而影響瘢痕的形成，并且傷口處炎癥強度與最終瘢痕形成的面積呈正相關[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，曲安奈德組兔耳創(chuàng)面瘢痕炎癥因子表達水平顯著低于模型組，而聯(lián)合治療組兔耳創(chuàng)面瘢痕炎癥因子表達更低，提示BMSCs聯(lián)合曲安奈德治療可能通過抑制瘢痕內(nèi)部炎癥反應而抑制增生性瘢痕的形成，這與Xie 等[17]的研究結果是一致的。Xie 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以通過下調創(chuàng)面瘢痕內(nèi)p-IKBα/IKBα、p-p65/p65、p-JNK/JNK和pc-JUN/c-JUN的表達，而瘢痕內(nèi)炎癥因子的表達，最終通過抑制瘢痕內(nèi)炎癥而抑制增生性瘢痕的形成。

炎癥細胞是炎癥反應的執(zhí)行者。在典型傷口愈合過程的炎癥階段，免疫細胞被認為主要用于防止病原微生物的入侵。然而，免疫細胞的失調會改變傷口愈合的結果并導致增生性瘢痕的形成，尤其是巨噬細胞。巨噬細胞是極其異質的可塑性細胞，在生理條件下，而且在炎癥期間都具有重要作用。巨噬細胞能夠響應許多不同的刺激而改變它們的表型，這個過程被稱為激活或極化，由此巨噬細胞也被分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[18-19]。M1型巨噬細胞主要表現(xiàn)為促進炎癥反應，而M2型巨噬細胞則主要表明為炎癥修復或抑制炎癥反應[18-19]。本研究表明，BMSCs聯(lián)合曲安奈德治療可顯著抑制M1型巨噬細胞表面標志物表達，而顯著促進M2巨噬細胞表面標志物表達，表明BMSCs聯(lián)合曲安奈德可促進兔耳瘢痕內(nèi)M2巨噬細胞的極化，這與Xu 等[20]的研究結果是一致的。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以通過促進M2巨噬細胞極化而減輕體內(nèi)炎癥。

綜上所述，BMSCs聯(lián)合曲安奈德對兔耳增生性瘢痕的形成具有抑制作用，其機制可能與促進M2巨噬細胞極化，降低瘢痕的炎癥反應有關。