利用高效液相色譜法測(cè)定山西中條山五味子2種有機(jī)酸的含量

張彩紅，史 鵬，楊延青，常茂林

(山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

五味子為常用中藥材，對(duì)失眠、多汗、腹瀉、疲勞、神經(jīng)衰弱等疾病具有一定的治療效果[1,2]。有研究表明，五味子中含有豐富的有機(jī)酸，包括檸檬酸、蘋果酸[3]等。山西中條山太寬河保護(hù)區(qū)分布的野生五味子資源豐富，筆者通過高效液相色譜法測(cè)定其果實(shí)中有機(jī)酸的含量，以期為促進(jìn)山西省野生五味子資源的合理開發(fā)和利用提供理論支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

試驗(yàn)材料為山西中條山太寬河保護(hù)區(qū)內(nèi)分布的野生五味子果實(shí)，選擇6個(gè)不同產(chǎn)地的優(yōu)樹果實(shí)，分別標(biāo)記為sj-001、sj-002、sj-003、sj-004、sj-005、sj-006。

1.2 試劑

試驗(yàn)試劑包括檸檬酸標(biāo)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)、L-蘋果酸標(biāo)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、H3PO4(分析純)、HCl(分析純)、無水乙醇(分析純)。試驗(yàn)用水為經(jīng)超純水機(jī)處理的一級(jí)水。

1.3 儀器

試驗(yàn)儀器包括Aglient 1260 Ⅱ高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)，美國(guó)安捷倫公司；混勻振蕩器，Heidolph公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；超純水機(jī)(Milli-Q)，Millipore公司；電子天平(精度0.000 1 g)，賽多利斯公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(150.0 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)安捷倫公司。流動(dòng)相A為乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脫15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)。流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取L-蘋果酸標(biāo)品、檸檬酸標(biāo)品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10 mg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存。取適量?jī)?chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相(A∶B=15∶85)稀釋至刻度，搖勻。逐級(jí)稀釋成系不同濃度的對(duì)照品。

2.3 供試溶液的制備

將五味子樣品烘干、粉碎、過篩后備用。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g的五味子樣品于三角瓶中，加入20 mL提取劑(甲醇和H2O的體積比為60∶40)，超聲振蕩提取30 min，離心，收集殘?jiān)M(jìn)行再提取。取出提取液冷卻至室溫，混合2次提取液,定容至50 mL，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，待上機(jī)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。精密吸取10 μL混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

2)線性關(guān)系考察。配置50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為Y，對(duì)照品溶液濃度為X，進(jìn)行回歸分析。

3)精密度試驗(yàn)。精密吸取同一濃度的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，分別計(jì)算2種有機(jī)酸的峰面積RSD。

4)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一五味子樣品5份，按2.3項(xiàng)的方法制備供試溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算2種有機(jī)酸的峰面積RSD。

5)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取同一五味子樣品1.000 0 g，按2.3項(xiàng)的方法制備供試溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每8 h進(jìn)樣1次，共測(cè)定5次，分別計(jì)算2種有機(jī)酸的峰面積RSD。

6)加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取5份1.000 0 g的五味子樣品，按照2.3項(xiàng)的方法制備供試溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算2種有機(jī)酸的加樣回收率和RSD。

2.5 五味子有機(jī)酸含量的測(cè)定

將6個(gè)產(chǎn)地的五味子樣品分別按2.3項(xiàng)的方法制備供試溶液，再按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣10 μL，采集色譜圖。根據(jù)色譜圖中待測(cè)成分的峰面積計(jì)算6個(gè)供試品中的有機(jī)酸含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

1)系統(tǒng)適用性。對(duì)照品溶液的L-蘋果酸和檸檬酸HPLC圖譜見圖1和圖2。

圖1 對(duì)照品溶液的L-蘋果酸HPLC圖譜

圖2 對(duì)照品溶液的檸檬酸HPLC圖譜

由圖1和圖2可知，混合對(duì)照品溶液中L-蘋果酸和檸檬酸的分離度均大于1.5，系統(tǒng)適用性良好。

2)線性關(guān)系。2種有機(jī)酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)與線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

由表1可以看出，L-蘋果酸的回歸方程為Y=0.444 3X+0.637 7，檸檬酸的回歸方程為Y=0.407 8X+3.150 3，2種有機(jī)酸的峰面積與對(duì)照品溶液濃度線性關(guān)系良好，R2均大于0.999 0。

3)精密度。精密度試驗(yàn)中，2種有機(jī)酸的峰面積RSD均為1.45%～2.63%，表明儀器精密度良好。

4)重復(fù)性。重復(fù)性試驗(yàn)表明，供試溶液2種有機(jī)酸的峰面積RSD均為1.21%～2.25%，表明此方法的重復(fù)性良好。

5)穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，供試溶液2種有機(jī)酸的峰面積RSD均為0.89%～1.60%，表明供試溶液在40 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6)加樣回收率。2種有機(jī)酸的加樣回收率和RSD見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 %

由表2可知，2種有機(jī)酸的平均回收率均大于97%，RSD達(dá)到1.7%以上，加樣回收率測(cè)定結(jié)果符合相關(guān)要求。

3.2 五味子有機(jī)酸含量

山西中條山太寬河保護(hù)區(qū)6個(gè)產(chǎn)地的五味子有機(jī)酸高效液相色譜圖見圖3。根據(jù)色譜圖中待測(cè)成分峰面積計(jì)算6種供試品中的L-蘋果酸含量和檸檬酸含量，結(jié)果見表3。

由表3可知，山西中條山野生五味子中的L-蘋果酸和檸檬酸含量平均為(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g。不同產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量存在極顯著性或顯著性差異。其中，sj-005的L-蘋果酸含量最高，為(39.565±2.338) mg/g，sj-005和sj-006的檸檬酸含量最高，分別為(89.437±4.808)mg/g和(87.883±5.570) mg/g。

圖3 五味子樣品高效液相色譜圖

表3 五味子樣品中L-蘋果酸和檸檬酸含量 mg/g

4 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸的液相色譜條件應(yīng)設(shè)置為流動(dòng)相A為乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脫為15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)，該方法具有分析速度快、線性范圍寬、精密度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)。用此方法測(cè)得山西中條山太寬河保護(hù)區(qū)6個(gè)產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量平均為(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g，不同產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量存在極顯著性或顯著性差異。