甲氨蝶呤對活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群的影響研究

徐水明，曾國興，楊清媛，許俊來，劉堯秀

（贛州市立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江西 贛州 341000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床較為常見的自身免疫性疾病，其常合并有間質(zhì)性肺炎以及慢性心功能疾病［1］。主要臨床特征包括滑膜炎及增生。臨床研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性疾病的進(jìn)展與機(jī)體的T 細(xì)胞活化顯著相關(guān)［2］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為1%［3］。其發(fā)病原因尚不明確，其發(fā)病可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)以及環(huán)境因素等呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。近年研究顯示，腸道菌群與宿主的免疫狀態(tài)顯著相關(guān)［4］。當(dāng)機(jī)體的腸道菌群平衡被打破，而呈現(xiàn)紊亂狀態(tài)，腸道的通透性顯著上升，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體的B 細(xì)胞以及T 細(xì)胞分化，炎性反應(yīng)呈現(xiàn)級聯(lián)式發(fā)展，在一定程度上造成了自身免疫性疾病的發(fā)展［5］。在疾病的進(jìn)展中，腸道細(xì)胞T 細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步誘導(dǎo)B 細(xì)胞的抗體產(chǎn)生［6］，通過抗原-抗體沉積物在關(guān)節(jié)部位的沉積作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎［7］。本研究主要通過甲氨蝶呤對活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行治療，評價其對腸道菌群的影響，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料本研究采取前瞻性研究，選取我院2020年4月—2021年9月期間收治的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者30 例作為研究對象，其中男11 例，女19 例，年齡31～69歲，平均（59.11±1.09）歲，體重指數(shù)平均（24.32±2.56） kg·m-2，根據(jù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情評價（DAS28 評分）［8］，其中低度活動患者10 例，中度活動患者9 例，高度活動患者11 例，另選取同期進(jìn)行健康體檢的志愿者30 例組作為對照組，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 兩組一般資料比較

患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合類風(fēng)濕的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能異常；②其他自身免疫性疾??；③精神或認(rèn)知功能障礙；④合并惡性腫瘤者等。

1.2 研究方法收集所有研究對象的大便5 g，取100 mg糞便置于2 mL的離心管中，在離心管中加入buffer TE 以及Lysozyme100 μL，放置于37 ℃的恒溫儀中溫浴10 min，溫浴結(jié)束后，13 300 r·min-1離心10 min，取上清液。同時在含有沉淀物的離心管中進(jìn)行加入buffer TE L1以及Foregene Protease 50 μL，反復(fù)進(jìn)行混勻，將離心管在65 ℃進(jìn)行水浴5 min，再次13 300 r·min-1離心10 min，取上清液移到新的離心管中。同時在該離心管中加入buffer TE L1 200 μL，混勻后靜置2 min，13 300 r·min-1離心10 min，取上清液600 μL，同時加入600 μL buffer TE L3，混勻后，將離心管在65 ℃進(jìn)行水浴5 min，再次混勻后，加入240 μL 無水乙醇，充分渦旋10 s，收集在管壁進(jìn)行附著的液滴。同時在離心管中進(jìn)行離心，使用800 μL 的混合液加入到離心柱中，12 000 r·min-1離心1 min，將收集到的液滴，使用500 μL buffer PW，12 000 r·min-1離心1 min，再次將收集到的液滴，使用700 μL buffer WB，12 000 r·min-1離心1 min，重復(fù)以上操作14次，最后將收集的液體進(jìn)行最后離心。收集糞便中的洗脫液。將以上洗脫液使用qPCR 對細(xì)菌16Sr 的DNAV4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性1 min，隨后98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30 次，最后在72 ℃ 5 min，使用NEB DNA 試劑盒進(jìn)行測序。

所有患者均采取甲氨蝶呤進(jìn)行治療，治療3個月。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1腸道菌群α多樣性指數(shù)通過對檢測結(jié)果，進(jìn)行稀釋性曲線分析，分別對治療前兩組患者的腸道菌群α多樣性指數(shù)（observed species、Chao 1指數(shù)、Gini-Simpsom指數(shù)、shannon指數(shù)）進(jìn)行比較。

1.3.2腸道菌群觀察兩組患者及不同程度患者治療前后的腸桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗進(jìn)行比較。計數(shù)數(shù)據(jù)采用n（%）表示，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察組與對照組患者腸道菌群α多樣性指數(shù)比較觀察組observed species（t=-4.871，P=0.000）、Gini-Simpson 指數(shù)（t=-3.919，P=0.000）及shannon指數(shù)（t=-5.036，P=0.000）顯著低于對照組，見表2。

表2 觀察組與對照組患者α多樣性指數(shù)比較/±s

表2 觀察組與對照組患者α多樣性指數(shù)比較/±s

組別觀察組對照組n 30 30 tP shannon 5.12±0.55 5.99±0.77-5.036 0.000 observed species 431.60±21.96 459.21±21.95-4.871 0.000 Chao 1 459.37±51.57 478.63±51.33-1.450 0.152 Gini-Simpson 0.91±0.11 0.99±0.02-3.919 0.000

2.2 觀察組不同嚴(yán)重程度患者α多樣性指數(shù)比較不同嚴(yán)重程度患者的observed species（F=12.369，P=0.000）、Gini-Simpson 指數(shù)（F=20.785，P=0.000）以及shannon 指數(shù)（F=69.491，P=0.000）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 觀察組不同嚴(yán)重程度患者α多樣性指數(shù)比較/±s

表3 觀察組不同嚴(yán)重程度患者α多樣性指數(shù)比較/±s

組別低度活動組中度活動組高度活動組n 10 9 11 FP Chao 1 465.65±51.05 460.18±51.75 453.00±51.81 1.552 0.096 LSD-t（低度 vs 中度）P LSD-t（低度 vs 高度）P LSD-t（高度 vs 中度）P observed species 435.87±23.46 430.79±23.54 425.65±21.80 12.369 0.000 12.585 0.000 10.009 0.000-10.971 0.000——--Gini-Simpson 0.95±0.11 0.90±0.05 0.88±0.12 20.785 0.000 0.285 0.296 7.881 0.000-9.881 0.000 shannon 5.33±1.04 5.06±1.01 4.98±1.02 69.491 0.000 10.226 0.000 9.125 0.000-11.521 0.000

2.3 觀察組與對照組腸道菌群比較觀察組患者的腸桿菌顯著高于對照組（t=2.221，P=0.030），乳桿菌（t=-5.586，P=0.000）、雙歧桿菌（t=-2.590，P=0.012）顯著低于對照組，見表4。

表4 觀察組及對照組腸道菌群比較/±s

表4 觀察組及對照組腸道菌群比較/±s

組別觀察組對照組n 30 30 t P腸桿菌8.95±1.12 8.01±2.03 2.221 0.030乳桿菌8.52±0.11 8.78±0.23-5.586 0.000雙歧桿菌8.91±2.36 10.70±2.96-2.590 0.012

2.4 觀察組不同嚴(yán)重程度患者的腸道菌群比較

不同嚴(yán)重程度患者的腸桿菌（F=10.363，P=0.000）、乳桿菌（F=11.236，P=0.000）、雙歧桿菌（F=11.777，P=0.000）水平之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

表5 觀察組不同嚴(yán)重程度患者的腸道菌群比較/±s

表5 觀察組不同嚴(yán)重程度患者的腸道菌群比較/±s

組別低度活動組中度活動組高度活動組n 雙歧桿菌9.62±1.51 8.99±1.75 8.20±1.54 11.777 0.000 12.552 0.000 8.881 0.000-12.039 0.000 10 9 11 FP LSD-t（低度 vs 中度）P LSD-t（低度 vs 高度）P LSD-t（高度 vs 中度）P腸桿菌8.77±1.24 8.93±3.31 9.13±1.24 10.363 0.000-11.230 0.000-12.030 0.000 11.003 0.000乳桿菌8.74±1.94 8.51±1.27 8.33±1.17 11.236 0.000 10.303 0.000 12.652 0.000-11.541 0.000

2.5 觀察組治療前后患者的腸道菌群比較經(jīng)過治療后，患者的腸桿菌（t=-2.169，P=0.034）低于治療前，乳桿菌（t=3.511，P=0.001）、雙歧桿菌（t=2.076，P=0.042）高于治療前，見表6。

表6 觀察組治療前后患者的腸道菌群比較/±s

表6 觀察組治療前后患者的腸道菌群比較/±s

組別治療前治療后n 30 30 t P腸桿菌9.55±1.02 8.95±1.12-2.169 0.034乳桿菌8.11±0.63 8.52±0.11 3.511 0.001雙歧桿菌7.92±1.12 8.91±2.36 2.076 0.042

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床較為常見的自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)部位的慢性炎癥反應(yīng)、骨破壞以及骨侵蝕等［10］。在眾多自身免疫性疾病的研究中，腸道菌群的平衡性與疾病的進(jìn)展呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性［11］。當(dāng)患者的腸道菌群發(fā)生顯著的失衡，腸道自身的反應(yīng)性T 細(xì)胞被顯著激活，進(jìn)一步增加機(jī)體對于關(guān)節(jié)炎的敏感性，同時由于異常的菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，也在一定程度上對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)行誘導(dǎo)［12］。在腸道菌群的研究中，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物丁酸鹽可在一定程度上促進(jìn)結(jié)腸組織的T細(xì)胞分化，進(jìn)而對機(jī)體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)［13］。以往的研究已經(jīng)證實［14］，當(dāng)患者的腸道中以普世菌擴(kuò)增為主導(dǎo)，患者的嘌呤代謝顯著降低，在一定程度上影響甲氨蝶呤的治療效果。

本研究中，通過對觀察組以及對照組的細(xì)菌豐富情況進(jìn)行比較，觀察組患者的腸道細(xì)菌的豐富程度顯著低于對照組，同時，通過對腸桿菌、球桿菌以及雙歧桿菌分析，觀察組患者的以上菌群的分布情況顯著發(fā)生改變，同時此種改變，隨著疾病的活動度的上升，其改變程度顯著升高。在對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的治療中，主要采取非甾體類藥物進(jìn)行治療，此類藥物已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，對于胃腸道的黏膜產(chǎn)生一定的影響［14］。本研究中，經(jīng)甲氨蝶呤治療后，患者的腸桿菌呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，乳桿菌以及雙歧桿菌呈現(xiàn)顯著的上升趨勢。提示，通過對患者的雙歧桿菌以及乳桿菌的治療，可顯著提升類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的治療效果［15］。正常的腸道菌群還對Th1 以及Th17 有顯著下調(diào)作用，進(jìn)一步促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的免疫耐受作用。而在免疫細(xì)胞中，Treg具有顯著降低炎性反應(yīng)的水平。同時Th17 以及Treg 下調(diào)之間的失衡，在一定程度上造成自身免疫反應(yīng)的上升。同時在免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的白介素6還可通過對Th1 以及Th17 的失衡狀況進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)一步改善患者的治療效果，所以在對患者的治療中，建議患者增加益生菌治療［16］。

綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群的豐度以及數(shù)量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，在對患者的短期治療中，其豐度以及數(shù)量呈現(xiàn)顯著回升。提示甲氨蝶呤短期治療對活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群具有正面影響。