三七生藥粉乙醇滅菌工藝優(yōu)化及不同滅菌方式對質(zhì)量的影響△

崔琳琳，陳寧，曹玲，孫艷，杜崇民，金宗元，張育龍，李晨鵬，高艷紅*

1.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；

2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；

3.青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，具有散瘀止痛、消腫定痛的功效，臨床上主要用于治療咯血、吐血、跌撲腫痛等[1]。很多中成藥，如三七片、三七傷藥片/膠囊等含有的三七需要直接打粉入藥，中藥打粉入藥往往攜帶大量的微生物[2-3]。因此，生藥粉入藥前需要進行滅菌處理，使其微生物含量在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版的限定范圍之內(nèi)。目前，對三七滅菌工藝的研究大多為輻照滅菌[4-6]，雖然輻照滅菌效果理想，但其輻照劑量超標對身體產(chǎn)生的安全性問題一直存在爭議，消費者對經(jīng)過輻照滅菌的產(chǎn)品存有安全疑慮[7-8]。張海江等[9]采用75%乙醇對三七進行滅菌，能很好地達到滅菌效果，但未對其他滅菌方式進行研究。

本研究以三七生藥粉為研究對象，以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1含量，皂苷總量和滅菌率的綜合評分為指標，采用響應(yīng)面法優(yōu)選三七乙醇滅菌工藝，同時與常規(guī)滅菌方法進行質(zhì)量對比研究，對乙醇滅菌技術(shù)的優(yōu)勢進行探討，為后續(xù)制劑開發(fā)及研究提供參考。

1 材料

2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XS105DU 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；GZX-9240MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MQS0.6 型脈動真空滅菌柜（張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備有限公司）。

三七（安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，批號：2110009），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖；對照品人參皂苷Rg1（批號：110703-202034，純度：94.0%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202129，純度：96.0%）、三七皂苷R1（批號：110745-201820，純度：90.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均購自美國天地有限公司；磷酸（純度≥85.0%）、乙醇均購自南京化學(xué)試劑有限公司；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七生藥粉滅菌方法

2.1.1三七生藥粉制備 取三七，粉碎過四號篩，備用。

2.1.2滅菌樣品的制備 稱取三七生藥粉200 g，采用乙醇滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、干熱滅菌方法制備三七生藥粉的滅菌樣品。濕熱滅菌：脈動真空滅菌柜115 ℃滅菌30 min，置于鼓風(fēng)干燥機中，70 ℃下干燥3～4 h；干熱滅菌：烘箱160～170 ℃滅菌150 min；輻照滅菌：60Co 射線6 kGy 輻照滅菌；乙醇滅菌：75%乙醇浸潤，密閉3 h，放入鼓風(fēng)干燥箱中，70 ℃下干燥3～4 h。

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件Welch Ultimate?PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（B）-水（A）梯度洗脫（0～12 min，19%B；12～60 min，19%～36%B）；柱溫為30 ℃；檢測波長為203 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.088 04、0.125 40、0.130 40 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版（一部）“三七”含量測定項下方法制備供試品溶液。

2.2.4線性關(guān)系考察 分別取2.2.2項下對照品溶液，三七皂苷R1質(zhì)量濃度分別為0.088 0、0.176 1、0.440 2、0.880 5、1.320 6、1.760 8 mg·mL-1，人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度分別為0.152 4、0.304 8、0.762 0、1.524 0、2.286 1、3.048 2 mg·mL-1，人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為0.130 4、0.260 8、0.652 3、1.304 2、1.956 8、2.608 1 mg·mL-1，注入液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y）、含量為橫坐標（X）繪制標準曲線，得人參皂苷Rg1回歸方程：Y=362 605X-5 805.6（r=0.999 8），人參皂苷Rb1回歸方程：Y=267 371X-4 729.1（r=0.999 4），三七皂苷R1回歸方程：Y=134 980.96X+6 110.72（r=0.999 2）。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在0.152 40～3.048 10 μg 線性關(guān)系良好，人參皂苷Rb1在0.130 40～2.608 20 μg 線性關(guān)系良好，三七皂苷R1在0.088 04～1.760 80 μg線性關(guān)系良好。

2.3 滅菌率測定

采用平板計數(shù)法對制備的樣品菌總數(shù)進行測定，該法出自《中國藥典》2020 年版（四部）1105 通則項下的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢測法，按公式（1）、（2）計算滅菌率[10]。

2.4 層次分析法（AHP）確定權(quán)重系數(shù)

根據(jù)《中國藥典》2020年版對三七含量測定成分要求，對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量，三者皂苷總含量和滅菌率權(quán)重指標予以量化。將5個指標分為2個層次，確定5項指標的順序為皂苷總含量=滅菌率＞三七皂苷R1=人參皂苷Rg1=人參皂苷Rb1。構(gòu)建的指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣見表1。根據(jù)評分結(jié)果，AHP法計算得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三者皂苷總含量和滅菌率的權(quán)重系數(shù)分別為0.11、0.11、0.11、0.33、0.33，一致性比例因子（CR）=0＜0.1，指標優(yōu)先比較判斷矩陣具有較好的一致性，權(quán)重系數(shù)有效。

表1 三七滅菌工藝權(quán)重層次分析指標成對比較的優(yōu)先矩陣

2.5 乙醇滅菌工藝單因素試驗

2.5.1乙醇體積分數(shù)對綜合指標的影響 在乙醇用量25%、干燥溫度65 ℃、滅菌時間2 h 條件下，考察不同乙醇體積分數(shù)（45%、55%、65%、75%、85%、95%）對綜合評分的影響，結(jié)果見圖1。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，綜合評分先增加后下降，其中乙醇用量對三七中皂苷含量影響較小，對滅菌率的影響較大，在乙醇體積分數(shù)75%條件下，滅菌率最高，因此選擇65%、75%、85% 乙醇做后續(xù)實驗。

圖1 乙醇體積分數(shù)對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.2乙醇用量對綜合指標的影響 在乙醇體積分數(shù)75%、干燥溫度65 ℃、滅菌時間2 h 條件下，考察不同乙醇用量（15%、20%、25%、30%、35%、40%）對綜合評分的影響，結(jié)果見圖2。隨著乙醇用量的增加，綜合評分先增加后緩慢下降，其中乙醇用量＞30%時，三七中皂苷含量出現(xiàn)降低趨勢，在乙醇用量25%條件下，滅菌率最高，隨著乙醇用量的增加，滅菌率基本不變，因此選擇20%、25%、30%的乙醇用量做后續(xù)實驗。

圖2 乙醇用量對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.3滅菌時間對綜合指標的影響 在乙醇體積分數(shù)75%、乙醇用量25%、干燥溫度65 ℃條件下，考察滅菌時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對綜合評分的影響，結(jié)果見圖3。隨著滅菌時間的增加，綜合評分先增加后趨于平緩，在2 h之前滅菌率隨著滅菌時間的增加而增加，2 h時滅菌率最高，2 h之后滅菌率基本不變，因此選擇1.5、2.0、2.5 h做后續(xù)實驗。

圖3 滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.4干燥溫度對綜合指標的影響 在乙醇體積分數(shù)75%、乙醇用量25%、滅菌時間2 h條件下，考察不同干燥溫度（45、55、65、75、85、95 ℃）對綜合評分的影響，結(jié)果見圖4。當干燥溫度低于85 ℃時，綜合評分變化不大，對皂苷含量和滅菌率的影響均較小，當干燥溫度＞85 ℃時，三七中皂苷的含量顯著下降，考慮到時間、成本等因素，因此選擇65、75、85 ℃做后續(xù)實驗。

圖4 干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇滅菌工藝

2.6.1方案設(shè)計及試驗結(jié)果 依據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，進行因素水平設(shè)計與試驗。因素水平見表2，設(shè)計及結(jié)果見表3～4。

表2 三七乙醇滅菌工藝響應(yīng)面因素水平

表3 三七乙醇滅菌工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.6.2方差分析和擬合回歸方程 利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行二次多元回歸分析，響應(yīng)值與各因素的回歸方程：Y=36.100-0.081A+0.037B+0.170C-0.076D-0.040AB-0.130AC+0.033AD+0.200BC+0.120BD-0.017CD-0.420A2-0.150B2-0.480C2-0.330D2，方差分析結(jié)果見表4。模型的F值為40.19、P值＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P值為0.134 2，說明非試驗因素對試驗結(jié)果影響不大，模型成立。其中滅菌時間對綜合評分有極顯著影響，乙醇體積分數(shù)和干燥溫度對綜合評分影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義，乙醇用量對綜合評分影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平（P＜0.001）。各因素的影響順序為滅菌時間＞乙醇體積分數(shù)＞干燥溫度＞乙醇用量，交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖5～10。

圖5 乙醇體積分數(shù)和乙醇用量對三七滅菌工藝綜合評分的影響

表4 三七滅菌工藝響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.6.3驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面模型和結(jié)果分析，得到三七粉最佳滅菌工藝為乙醇體積分數(shù)73.50%、乙醇用量26.47%、滅菌時間2.13 h、干燥溫度74.39 ℃，在此滅菌條件下綜合評分為36.137 3分。結(jié)合實際生產(chǎn)及可操作性，將滅菌條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù)74%、乙醇用量26%、滅菌時間2.2 h，干燥溫度75 ℃，在此條件下進行3次驗證實驗，結(jié)果見表5。

由表5 可知，3 次驗證實驗平均綜合評分為36.19 分，RSD 為0.161%，表明該工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性好，可作為三七滅菌工藝。

表5 三七滅菌工藝響應(yīng)面平行驗證實驗結(jié)果

2.7 不同滅菌方式對三七質(zhì)量的影響

2.7.1微生物限度對比 按 《中國藥典》2020 年版（四部）通則 1108 中藥飲片微生物限度檢查法進行實驗，結(jié)果顯示，需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)均小于10 CFU·g-1，大腸埃希氏菌和活螨未檢出，各滅菌樣品均達到預(yù)期滅菌效果。

2.7.2《中國藥典》2020年版各自檢查結(jié)果對比 按《中國藥典》2020年版（一部）三七項下各項檢查要求，對滅菌前后三七鑒別項、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物、含量測定進行檢測，結(jié)果見表6。濕熱滅菌后，三七中皂苷的含量降低，總質(zhì)量分數(shù)＜5.0%，已不符合《中國藥典》2020年版標準。干熱滅菌后，三七中皂苷的含量也出現(xiàn)一定程度的減少，乙醇滅菌與輻照滅菌對含量影響較小。除含量測定外，其余各項檢測結(jié)果均符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定。

表6 三七不同滅菌方法樣品的《中國藥典》2020年版檢測結(jié)果

2.7.3指紋圖譜對比 精密稱取上述各樣品0.6 g，加入甲醇50 mL，放置過夜，置80 ℃水浴提取2 h，放冷，取續(xù)濾液，0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～15 min，21%B；15～20 min，21%～22%B；20～28 min，22%～32%B；28～42 min，32%～38%B；42～65 min，38%～85%B；65～75 min，85%～100%B）；檢測波長203 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL，結(jié)果見圖11，相似度結(jié)果見表7。乙醇滅菌、輻照滅菌和干熱滅菌指紋圖譜與未滅菌指紋圖譜的相似度均大于0.99，濕熱滅菌指紋圖譜與未滅菌指紋圖譜的相似度均小于0.99。

表7 三七不同滅菌方法樣品的指紋圖譜相似度

圖6 乙醇體積分數(shù)和滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖7 乙醇體積分數(shù)和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖8 乙醇用量和滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖9 乙醇用量和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖10 滅菌時間和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖11 三七不同滅菌方法樣品的指紋圖譜

3 討論

中藥直接打粉入藥的滅菌一直是中成藥生產(chǎn)過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié)。由于中藥的生長、采收和制備的特殊性，大多數(shù)的中藥原料藥都不同程度地帶有一些細菌、霉菌或其他致病菌[11]。目前常規(guī)滅菌方法有濕熱滅菌、干熱滅菌、輻照滅菌、乙醇滅菌、微波滅菌、紫外滅菌等，選用適當?shù)臏缇椒?，保證滅菌后的中藥生藥粉內(nèi)在質(zhì)量的同時，又能滿足微生物限度的要求[2]。因此，本研究通過對比4 種不同滅菌方法，對滅菌前后樣品進行檢測，結(jié)果顯示4 種滅菌方法鑒別、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物和微生物限度均符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定，但是濕熱滅菌后三七中皂苷含量顯著下降，已低于《中國藥典》2020 年版標準，且與生藥材相比指紋圖譜相似度最低，說明三七不適合濕熱滅菌，這與王影等[12]的研究結(jié)果一致。干熱滅菌同樣也會引起皂苷含量的降低。乙醇滅菌與輻照滅菌對皂苷成分影響較小，與生藥材相比指紋圖譜相似度較高，但是輻照滅菌存在殘留問題且生產(chǎn)成本較高，而乙醇滅菌法在較短時間內(nèi)就能把微生物殺滅，且對三七質(zhì)量沒有影響，具有滅菌效果可靠、工藝設(shè)備簡單、操作方便、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)勢，在實際大生產(chǎn)中是一種常用、經(jīng)濟的滅菌手段，可以作為三七生藥粉的滅菌方法。

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化三七乙醇滅菌工藝。結(jié)果顯示，最佳滅菌工藝為乙醇體積分數(shù)74%、乙醇用量26%、滅菌時間2.2 h、干燥溫度75 ℃，在此滅菌條件下綜合評分為36.19分。在此條件下不僅提高了滅菌率，也更大程度保證了三七皂苷類成分不被破壞，保證了滅菌后三七的質(zhì)量，為三七直接打粉入藥的滅菌工藝應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)，可為三七后續(xù)制劑的開發(fā)利用提供參考。